楊帥 王月 李根 張亮亮 李楠，4 張會存 伊比然恨 汪紅兵,,4**

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院消化科，北京 100010；2.拉薩市人民醫(yī)院，西藏 拉薩 850000；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院；5.北京中醫(yī)研究所，北京 100010）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）是一種定植于人胃粘膜呈螺旋狀的革蘭氏陰性菌，由于自身獨特結(jié)構(gòu)和黏附素等因素使其得以黏附、定植胃粘膜上皮細(xì)胞，使宿主出現(xiàn)炎癥反應(yīng)造成胃黏膜的損傷[1,2]。同時，Hp 擾亂胃上皮細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期，通過抑制或逃避免疫應(yīng)答的方式存活于機體內(nèi)[3,4]，顯著影響胃內(nèi)菌群的構(gòu)成，其相對豐度的變化直接影響胃黏膜DNA 的修復(fù)途徑[5,6]，是慢性胃炎及炎癌轉(zhuǎn)化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中主要原因，被認(rèn)為是I 型致癌因子。因此，根除Hp，尤其在胃粘膜發(fā)生萎縮、腸上皮化生前，可降低胃癌的發(fā)生率[7]。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有幽門螺桿菌侵襲人體致病之說，是將Hp 視歸為“外邪”。Hp 感染的發(fā)病大致可分為內(nèi)外二因：內(nèi)因多責(zé)之脾胃虧虛、七情內(nèi)傷以及飲食不節(jié)；外因多責(zé)之毒邪、外感六淫之邪氣侵襲。由于古代醫(yī)家多將其視作外邪致病，因此，并沒有具體明晰的病名產(chǎn)生，而是根據(jù)其感染的病位將其大致屬“胃脘痛”“痞滿”“吞酸”之類[8,9]。科學(xué)實踐證明，傳統(tǒng)醫(yī)藥治療幽門螺桿菌感染具有良好的效能[10,11]?！案仕伞薄坝喔首印本俏覈湫偷拿褡逵盟帲绕湓诓蒯t(yī)體系中常用于治療消化系統(tǒng)疾病，具有良好的效能。其中，甘松，中醫(yī)認(rèn)為其味甘微辛，性溫，入脾胃、心經(jīng)，有溫中散寒，開郁醒脾，健脾開胃，理氣止痛的功效，為脾胃病治療之要藥[12,13]，在藏醫(yī)臨床作“榜貝”入藥，且用于治療“熱毒證”與“瘟疫癥”[14,15]，具有清熱、解毒之功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究亦表明其可促進(jìn)胃腸蠕動，能防治急性胃炎和急性胰腺炎，具有良好的消炎、抑菌作用[16]。余甘子，亦屬藏族習(xí)用藥材，又名余甘、庵摩勒等，中醫(yī)認(rèn)為其味甘、酸、澀，性涼，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳等功效[17]。在藏醫(yī)藥中，余甘子具有“眾藥之王”之稱，廣泛用于治療胃腸道疾病、肝膽病、血液病等。能抑制急性炎癥的發(fā)展，保護(hù)胃腸黏膜，抗胃腸潰瘍，且具有一定的殺菌作用[18,19]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究藏藥“甘松-余甘子”治療幽門螺桿菌相關(guān)胃炎的有效成分和作用機制。

1 方法

1.1 篩選活性化學(xué)成分

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Tradi‐tional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，活性化學(xué)成分篩選條件設(shè)置：口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18，篩選獲得甘松、余甘子活性化學(xué)成分。

1.2 幽門螺桿菌相關(guān)胃炎及化合物作用靶點預(yù)測與篩選

以“Helicobacter pylori gastritis”為關(guān)鍵詞，檢索“GeneCards”“OMIM”“DisGeNET”數(shù)據(jù)庫，查詢幽門螺桿菌相關(guān)胃炎基因靶標(biāo)；通過Drugbank 數(shù)據(jù)庫檢索活性化學(xué)成分的靶點，Drugbank 未能查詢到靶點的化學(xué)成分，使用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，將靶點相對應(yīng)的蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榉N屬為homo sapiens（智人）的基因預(yù)測靶點，將兩者作用靶點去重并匯總，導(dǎo)入Uniprot 數(shù)據(jù)庫，獲取最終的作用靶點基因。

1.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

獲得甘松、余甘子有效成分靶點與幽門螺桿菌相關(guān)胃炎靶點之后，通過R 語言中“venn”“randomcolor”R 包，取二者交集靶點獲取韋恩圖，作為甘松-余甘子與幽門螺桿菌相關(guān)胃炎共同作用靶點。

1.4 “蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將甘松-余甘子與幽門螺桿菌相關(guān)胃炎共同作用靶點基因通過R語言“ggsci”“tidyverse”“STRINGdb”“tidygraph”等相關(guān)R 包進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，設(shè)定物種為智人，獲取共有靶點基因相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。將共同交集靶點蛋白通過Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。綜合數(shù)據(jù)的度值，選取前4位的作用靶點作為核心靶點。

1.5 核心靶點基因功能分析

將交集靶點導(dǎo)入利用R 語言“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“ggnewscale”等相關(guān)R包相關(guān)功能進(jìn)行GO分析、KEGG分析。

1.6 分子對接驗證

將“1.4”篩選出的關(guān)鍵成分轉(zhuǎn)換為mol 格式，并通過PDB 數(shù)據(jù)庫獲取PDB 格式的核心靶標(biāo)3D 結(jié)構(gòu)；同時，使用PyMol 軟件、AutoDockTools 軟件作結(jié)構(gòu)修飾及加全氫、計算電荷等處理，保存為pdbqt 文件，完成分子對接驗證；保存最低結(jié)合能數(shù)據(jù)，運行Pymol軟件完成分子對接圖。

2 研究結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，化合物的初步篩選條件滿足OB≥30%，并且DL≥0.18。經(jīng)去重，共收集到活性化學(xué)成分15個，其中甘松4個、余甘子11個。DL數(shù)值前15的基本信息見表1。

表1 甘松-余甘子有效活性成分

2.2 篩選活性靶點

通過篩選Drugbank 數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Predic‐tion 數(shù)據(jù)庫，獲得甘松54 個、余甘子271個作用靶點；通過GeneCards、OMIM、DisGeNet在線數(shù)據(jù)庫，以“Helicobacter pylori gastritis”為關(guān)鍵詞查詢相關(guān)靶標(biāo)，共獲得相關(guān)靶點531 個，運用R 語言獲得16 個“甘松-余甘子、幽門螺桿菌相關(guān)胃炎”交集靶點，見圖1。

圖1 “甘松-余甘子、幽門螺桿菌相關(guān)胃炎”交集靶點

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)

運用Cytoscape 3.7.2軟件獲取“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，其中包含34 個節(jié)點，107 條邊，見圖2。Degree指與節(jié)點相連邊的數(shù)量。前4位的Degree排名化合物成分為：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(MOL006821，Degree=15)、槲皮素(MOL000098，Degree=13)、金合歡素(MOL001689，Degree=11)、木犀草素(MOL000006，Degree=10)，Degree 值見表2。以上化合物在發(fā)揮治療效用方面可能具有較大的貢獻(xiàn)。

圖2 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)

表2 Degree值

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集共表達(dá)靶點通過R 語言構(gòu)建String 網(wǎng)絡(luò)，將獲得PPI 信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中靶點對應(yīng)節(jié)點的大小、顏色的不同表示Betweenness（PPI 次數(shù)）值的差異，選取排名前4 位的靶點基因用紅色突出顯示；分析結(jié)果顯示共526 條關(guān)系線條，Betweenness 值前4 位的靶點基因PTGS2（Betweenness=15.32）、TNF（Betweenness=12.20）、CASP3（Betweenness=9.79）、TP53（Betweenness=9.79），Betweenness值見表3。

表3 Betweenness值

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 生物功能富集分析

為進(jìn)一步闡明甘松、余甘子的作用機制，采用R語言相關(guān)R包對交集靶點通過GO功能富集分析，得取生物過程（Biological Process，BP）1349 個，細(xì)胞組成（Cell Composition，CC）26 個，分子功能（Molecular Function，MF）69個。按P值排序（P＜0.05）將前20條繪圖表示，其中點越大表示富集基因數(shù)越多，顏色越紅表示藥物對疾病的干預(yù)越密切，主要涉及細(xì)胞器外膜、外部膜、膜筏、膜微域、線粒體外膜、核膜、細(xì)胞核膜等細(xì)胞成分；神經(jīng)元死亡調(diào)節(jié)、神經(jīng)元死亡、電離輻射響應(yīng)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、對紫外線的反應(yīng)、內(nèi)在的凋亡信號通路、皮質(zhì)類固醇反應(yīng)等生物過程；腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、BH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合、死亡域結(jié)合、死亡受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白酶結(jié)合等分子過程，見圖4（1）。對關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到73條信號通路，按P值排序(P＜0.05)將前20條繪圖表示P53信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、壞死性凋亡途徑等通路，見圖4（2）。通過KEGG-cnet可獲知細(xì)胞凋亡、乙型肝炎、麻疹、P53信號通路、鉑耐藥等分子信號途徑與疾病核心靶點有著密切的聯(lián)系，見圖4（3）。

圖4 生物功能富集分析

2.6 分子對接驗證

將“2.4”中篩選得到部分核心靶點（PTGS2、TNF、CASP3、TP53）與“2.3”中篩選獲取的部分核心成分進(jìn)行分子對接。篩選結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 的藥物分子，我們視作其與靶點存在結(jié)合活性，經(jīng)篩選，核心靶點與有效化學(xué)成分的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，結(jié)合能絕對值最大的為PTGS2與(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、木犀草素，STAT3 與(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯，各分子對接預(yù)測結(jié)合能見表4，預(yù)測結(jié)合位點見圖5。這也可以證明，甘松、余甘子活性化學(xué)成分可對核心靶點可發(fā)揮調(diào)控作用。

表4 靶點基因與核心化學(xué)成分對接預(yù)測結(jié)合能

圖5 靶點基因與核心化學(xué)成分分子對接圖

3 討論

藏藥甘松、余甘子常用于治療各種脾胃疾病，二者聯(lián)合應(yīng)用，不僅對幽門螺桿菌具有一定抑制作用，而且對于胃粘膜的修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用?？娠@著緩解患者的臨床癥狀，同時，也可以減輕胃黏膜炎癥反應(yīng)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探究“甘松”“余甘子”治療幽門螺桿菌相關(guān)胃炎的有效成分和作用機制。

根據(jù)“甘松-余甘子”藥對-有效成分-共同靶點-幽門螺桿菌相關(guān)胃炎網(wǎng)絡(luò)圖，得出Degree 值，按其大小選出4 種核心成分，依次為表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、金合歡素、木犀草素。表沒食子兒茶素沒食子酸酯化學(xué)成分可通過內(nèi)在途徑啟動細(xì)胞死亡，并抑制癌癥EGFR、STAT3、ERK、NF-κB 和Akt介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，可作為COX、NO 合酶、TNF 和白細(xì)胞介素信號通路的抑制劑，它通過激活p53 和PTEN/p21、發(fā)揮抗癌、抗氧化、抗炎、抗血管生成和凋亡作用［20］。槲皮素對胃黏膜上皮細(xì)胞有體外抗炎活性，通過抑制TNF-α 誘導(dǎo)的正常人胃上皮細(xì)胞基質(zhì)MMP-9 表達(dá)發(fā)揮作用，用于保護(hù)胃粘膜上皮細(xì)胞［21］。同時，槲皮素可作為一種非競爭性脲酶抑制劑，能夠耐受廣泛的結(jié)構(gòu)修飾［22］，顯著降低幽門螺桿菌導(dǎo)致的單核細(xì)胞的浸潤指數(shù)和幽門竇和胃體定植，減少了胃粘膜中的幽門螺桿菌感染炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化［23］。金合歡素是一種O-甲基化黃酮，通過降低COX-2 和NO 合酶的活性、蛋白質(zhì)和mRNA 表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄激活來顯示抗炎潛力，抑制TLR4、TRAIL-R1、IL-6、TNF-α、IL-5；降低JNK、P38 和ERK 磷酸化以及NF-κB的表達(dá)發(fā)揮抗微生物、抗炎、抗癌、抗氧化等生物活性。同時，調(diào)節(jié)腸道微生物，恢復(fù)小鼠腸道菌群平衡，抑制腸道炎癥［24,25］。木犀草素的主要藥理機制是其抗炎活性，這種活性來自其調(diào)節(jié)各種炎癥介質(zhì)，并改變炎癥中轉(zhuǎn)錄因子對STAT3/IRF-1、NF-κB 和AP-1 通路的調(diào)節(jié)［26］。同時，亦有研究證明，木犀草素對胃潰瘍患者幽門螺桿菌菌株生長和芳胺乙酰轉(zhuǎn)移酶活性具有抑制作用，木犀草素通過cMet/ Akt/ERK信號在cMet 過度表達(dá)的胃癌模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用,上調(diào)人胃癌細(xì)胞中的miR-34a來降低Bcl-2的表達(dá)，從而抑制炎癌轉(zhuǎn)化過程［27］。

幽門螺桿菌相關(guān)胃炎具有復(fù)雜的發(fā)病機制，多種炎癥相關(guān)分子及途徑在幽門螺桿菌相關(guān)胃炎中發(fā)揮重要作用。PTGS2 也稱為環(huán)氧化酶2（COX2），是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，其表達(dá)與炎性細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)相關(guān)，特別是胃泌素和活性氧［28］。研究證明，幽門螺桿菌相關(guān)的急性和慢性炎癥與胃上皮細(xì)胞中PTGS2 的表達(dá)有關(guān)，表達(dá)程度與慢性炎癥細(xì)胞浸潤的程度密切相關(guān)，PTGS2 的慢性表達(dá)，不僅導(dǎo)致胃炎持續(xù)存在，同時也在幽門螺桿菌相關(guān)胃炎癌變進(jìn)程中起重要作用［29］。TNF-α 是主要的免疫調(diào)節(jié)因子，能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在炎癥、腫瘤等眾多生理病理進(jìn)程中發(fā)揮作用［30］。研究證明，TNF-α 能抑制胃酸分泌，促進(jìn)幽門螺桿菌感染范圍擴大，誘導(dǎo)胃炎發(fā)生，同時，TNFα 促進(jìn)胃癌發(fā)生、細(xì)胞增殖、胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、新生血管形成等多個病理過程［31,32］。STAT3 是眾多致癌信號通路的匯聚點，在癌癥和非癌癥細(xì)胞中都廣泛超活化，并在抑制關(guān)鍵免疫激活調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和促進(jìn)免疫抑制因子的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。研究證明，幽門螺桿菌通過細(xì)胞毒素（cagA）激活的酪氨酸磷酸化的STAT3 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增加趨化因子表達(dá)，促進(jìn)黏膜炎癥的發(fā)生［33］。同時，在多種腫瘤中均可檢測到異?；罨?，幽門螺桿菌感染時，潛在轉(zhuǎn)錄因子STAT3 是許多致癌細(xì)胞過程的有效驅(qū)動因素，包括細(xì)胞增殖、存活和遷移、炎癥、血管生成和免疫抑制［34,35］。TP53 亦稱P53，是一種人體中重要的腫瘤抑制因子，幽門螺桿菌感染可通過激活PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA 損傷，干擾TP53 表達(dá)，進(jìn)而細(xì)胞周期失調(diào)、細(xì)胞增殖失衡，促進(jìn)炎癌轉(zhuǎn)變［35,36］。

KEGG 信號通路富集分析顯示“甘松-余甘子”的重要靶點主要富集于P53信號通路、HIF-1信號通路、TNF 信號通路等，主要發(fā)揮調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、抗癌等生物功能。P53 是與人類腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因，作為轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，基因突變可抑制P53 轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展［37］。HIF 是低氧調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，其激活可參與癌癥生物學(xué)關(guān)鍵方面的基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1α 可以在嚴(yán)重或持續(xù)缺氧的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［38,39］。研究發(fā)現(xiàn)，胃粘膜微循環(huán)障礙、持續(xù)缺血和缺氧是胃粘膜損害的重要因素。粘膜持續(xù)的缺血和缺氧會誘導(dǎo)HIF-1α 的高表達(dá)，HIF-1α 可以直接或間接結(jié)合p53 結(jié)構(gòu)域，增加p53 的穩(wěn)定性，加強p53 促進(jìn)凋亡的作用［39］。激活的p53 進(jìn)入細(xì)胞核，通過調(diào)節(jié)Bcl2和Bax 的表達(dá)啟動凋亡過程［40］，導(dǎo)致胃粘膜持續(xù)損害［41］。研究證明，幽門螺桿菌不僅通過穩(wěn)定HIF-1誘導(dǎo)了延長的M1 極化，而且阻止了向M2 巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)換，后者在炎癥中起著關(guān)鍵作用。靶向HIF-1已被證明對慢性炎癥有益，髓樣HIF-1 對幽門螺桿菌介導(dǎo)相關(guān)胃炎具有保護(hù)性抑制作用［42］。TNF-α相關(guān)信號通路參與多種炎癥與癌癥發(fā)生［32］，研究證明，幽門螺桿菌誘導(dǎo)TNF-α 在炎癥和癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，加強了Tip-α 作為一種致癌因子的作用，不同于幽門螺桿菌產(chǎn)生的CagA 和VacA，Tipα 通過與受體細(xì)胞結(jié)合，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和EMT，對促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄激活以及胃炎、胃腺癌的發(fā)展有重要作用［43］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，篩選出藏藥“甘松-余甘子”治療幽門螺桿菌相關(guān)胃炎的活性化學(xué)成分、關(guān)鍵作用靶點以及潛在作用機制，“甘松-余甘子”可通過多種化學(xué)組分及途徑改善幽門螺桿菌相關(guān)胃炎、保護(hù)胃粘膜，抑制炎癌轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，其中PTGS2、TNF、STAT3 和TP53 等靶點可能為“甘松-余甘子”發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點，而P53 信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等可能是“甘松-余甘子”發(fā)揮抗炎、抗癌、抗氧化、抗凋亡、促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵信號通路。本研究為“甘松-余甘子”用于治療幽門螺桿菌相關(guān)胃炎提供藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制參考。