王秀紅，楊曉敏，王雅婷，苑藝，陳蘭，孟德梅，2*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津 300300；3.天津盛天利材料科技有限公司，天津 300454）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一種營養(yǎng)價值高、全球消費普遍、種植面積廣且收成良好的食用菌[1]。但雙孢蘑菇在采后貯藏和銷售運輸中呼吸作用強、沒有角質(zhì)層的保護作用，極易受微生物侵染和機械損傷，導(dǎo)致褐變、子實體軟化等，失去商品價值。有研究表明，雙孢蘑菇在室溫（20℃～25℃）下的貯藏期只有1 d～3 d[2-3]。涂膜保鮮法操作簡單、成本低，可有效延長食用菌貯藏保鮮期[4]。生物源涂膜保鮮法常以無毒且廉價的多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)為基礎(chǔ)，加以抑菌和助膜材料制成復(fù)合生物源涂膜劑，且通過涂抹、浸泡等方法，將其覆于蘑菇的表面，使其形成一層透明且兼具多種性能的膜[5]。有研究報道，生物源涂膜可有效防止子實體內(nèi)外氣體和水分等相互遷移，抑制食用菌、番茄等[6-7]多種園藝產(chǎn)品的呼吸作用，進而延緩組織衰老，其應(yīng)用前景廣闊。

魔芋膠和卡拉膠是從植物中提取的多糖，屬于天然的食品添加劑。魔芋膠和卡拉膠復(fù)配主要依靠多糖間的協(xié)同作用，卡拉膠中半乳聚糖的硫酸酷基團可與魔芋膠中羥基形成氫鍵，從而提高復(fù)配凝膠強度[8-9]。二者復(fù)配的凝膠不但析水少、彈性大、脆度小，而且有著各單體膠所缺少的優(yōu)點，在生物源涂膜保鮮市場的應(yīng)用前景廣闊[10]。龐杰等[11]利用魔芋膠、卡拉膠為基質(zhì)配制保鮮薄膜，對食用菌和柑橘進行保鮮，結(jié)果表明，食用菌貯藏4 d后質(zhì)量損失率和褐變度僅為5.5%和0.11%，柑橘貯藏半個月后腐爛率低于2%。乳酸鏈球菌素（nisin）是一種由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的多肽物質(zhì)，其能夠抑制大部分革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、耐熱芽孢桿菌、小球菌等）的生長[12]。nisin因攝入后可快速被人體蛋白酶消化分解成各種氨基酸而不會對人體產(chǎn)生毒害作用[13]，已被用于各種食品保鮮[14]。ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種天然存在的陽離子抗菌肽，屬于安全性高的天然食品防腐劑，具有熱穩(wěn)定性好、水溶性好、抑菌譜廣等優(yōu)點[15]。近年來，ε-PL已經(jīng)被用于柑橘、蘋果、番茄等多種果蔬的采后防腐保鮮[16-17]，尤其是ε-PL與其它保鮮劑、抗菌劑等其它保鮮方法進行聯(lián)合使用后，能有效協(xié)同增強其保鮮效果，但在雙孢蘑菇采后保鮮中的研究還未見相關(guān)報道。為此，本文以魔芋膠和卡拉膠為主要成膜基質(zhì)，添加ε-PL和nisin抑菌劑制成生物源抑菌劑復(fù)合涂膜劑，以期提高雙孢蘑菇采后貯藏品質(zhì)、為雙孢蘑菇貯藏保鮮方法的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇：江蘇裕灌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司；魔芋膠、卡拉膠：浙江一諾生物科技有限公司；乳酸鏈球菌素：浙江新銀象生物工程有限公司；ε-聚賴氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；以上試劑均為分析純。Bradford法蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）測試盒、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）測試盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyH1/H1MF多功能酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；HW600水浴鍋：北京東方精瑞科技有限公司；WR-18色彩色差儀：深圳市威福光電科技有限公司；GY-4果實硬度計：浙江托普儀器有限公司；5810R冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 處理方法

挑選潔白完整、無病害、無機械損傷、直徑為3 cm～4 cm的雙孢蘑菇，將菌柄切至1 cm后，隨機分成3組，每組200個。對照組浸于蒸餾水中2 min，復(fù)合涂膜組浸于0.4%魔芋膠+0.2%卡拉膠中2 min，抑菌劑復(fù)合涂膜組浸于0.4%魔芋膠+0.2%卡拉膠+150 mg/L ε-PL+900 mg/L nisin中2 min。每個處理均重復(fù)3次。所有處理后的蘑菇置于干燥紙上晾干后，于溫度為（4±1）℃、濕度為85%～90%的冷庫中貯藏。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 感官評價

感官評價的指標包括雙孢蘑菇的顏色、氣味、狀態(tài)，每項指標各5分，滿分20分。以低于10分～12分為消費者不可以接受。采后雙孢蘑菇貯藏感官評分標準見表1。

表1 采后雙孢蘑菇貯藏感官評分標準Table 1 Sensory scoring standard of A.bisporus during postharvest storage

1.4.2 開傘率測定

開傘率的計算公式如下。

開傘率/%=開傘個數(shù)/雙孢蘑菇總數(shù)×100

1.4.3 失重率測定

取樣時稱取每組質(zhì)量。計算公式如下。

失重率/%=（G1-G2）/G1×100

式中：G1為貯藏前雙孢蘑菇質(zhì)量，g；G2為貯藏后雙孢蘑菇質(zhì)量，g。

1.4.4 色度測定

每組隨機選取7個雙孢蘑菇，每個菌蓋位置均勻選取3個點，利用WR-18色差儀，測量每個點的L*值和色度值（a*和b*），并用下述公式計算褐變度（browning index，BI）和 △E。

式中：△L*、△a*、△b* 分別為各樣品與對照組的L*、a*、b* 的差值。

1.4.5 硬度測定

每組隨機選取7個雙孢蘑菇，利用GY-4型果實硬度計測量，把硬度計垂直均勻地用力壓入雙孢蘑菇菌蓋中心部位5 mm，記下此時硬度計的數(shù)值[18]，最終取7次測定平均值。

1.4.6 呼吸速率的測定

將加入15 mL 0.4 mol/L NaOH的培養(yǎng)皿置于干燥器底部，10個雙孢蘑菇子實體放到隔板上，封蓋并記質(zhì)量，30 min后把培養(yǎng)皿從干燥器中取出。然后將NaOH移入燒杯，用10 mL蒸餾水洗滌3次，向其中加入2滴酚酞、5 mL飽和氯化鋇，然后用0.2 mol/L草酸滴定至溶液中紫紅色去除或消失，重新使樣品變回透明，同時記錄此時的草酸用量為V1，空白滴定（干燥器中沒有任何樣品）以相同的方法進行，記錄V2為此時草酸的用量。呼吸速率以每小時每千克子實體釋放的CO2質(zhì)量表示，計算公式如下。

呼吸速率/[mg/（kg·h）]=（（V2-V1）×C×44）/（W×H）

式中：V1為樣品滴定草酸的體積，mL；V2為空白滴定草酸的體積，mL；C為草酸濃度，0.2 mol/L；W為樣品鮮重，g；H 為測定時間，h。

1.4.7 可溶性蛋白的測定

取2 g樣品加6 mL、pH7.0的50 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液，充分研磨，在4℃條件下，10 000 r/min離心10 min，取上清。參照Bradford法蛋白濃度測定試劑盒的方法，將標準品稀釋至不同濃度，各取20 μL加入96孔板中，再加入200 μL 1×G250染色液，于20℃～25℃放置3 min～5 min后在595 nm下測定吸光度。按照上述制作標準曲線方法測定樣品中可溶性蛋白含量，計算公式如下。

可溶性蛋白含量/（g/kg FW）=（m'×V）/（Vs×m×1 000）

式中：m'為從標準曲線查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，μg；V為樣品提取液總體積，mL；Vs為測定時所取樣品提取液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.4.8 酶活測定

PPO、SOD、CAT和POD酶液的提取方法如下：稱取1 g樣品加入9 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液[pH 7.0，含 1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）]，充分研磨，4℃、10 000 r/min離心5 min。酶活測定方法參照相應(yīng)酶活測定試劑盒說明書。

1.4.9 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定

采用硫代巴比妥酸法測定MDA。樣品：提取液（10%三氯乙酸）（體積比1∶5）在冰浴下研磨，4℃、8 000 r/min離心10 min，吸取上清液。取0.2 mL上清液和0.6 mL 10%三氯乙酸（內(nèi)含0.5%硫代巴比妥酸，用0.05 mol/L NaOH配制），混合后煮沸20 min，冷卻至室溫（20℃～25℃），于10 000 r/min離心10 min，取上清液分別在532、600、450 nm測定吸光度。重復(fù)3次，取得平均值，計算公式如下。

MDA含量/（mmol/kg FW）=（c×V）/（Vs×m×1 000）

式中：c=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450，為反應(yīng)混合液中MDA濃度，μmol/L；V為樣品提取液總體積，mL；Vs為測定時所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel2019軟件對所有的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理，并用Origin2017制圖，SPSS21進行顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間感官品質(zhì)的影響

為明確不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間品質(zhì)的影響，對各組進行感官評價，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of different coating treatments on sensory quality of A.bisporus during postharvest storage

由圖1可知，對照組最先發(fā)生褐變和品質(zhì)下降現(xiàn)象，分別于第2、3、4天，開始出現(xiàn)輕微褐變、明顯病斑和腐爛的跡象，在貯藏第2、4、6天時的感官評分分別為14、6、4；復(fù)合涂膜處理組在貯藏第2、4、6天時的感官評分別為14、9、8，說明復(fù)合涂膜處理一定程度抑制了蘑菇貯藏中感官品質(zhì)的下降；抑菌劑復(fù)合涂膜組樣品感官品質(zhì)在貯藏期間最優(yōu)，于第4天出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，貯藏6 d內(nèi)未出現(xiàn)腐爛跡象，在貯藏第2、4、6天時的感官評分別為20、15、11。通過以上結(jié)果可以看出，抑菌劑復(fù)合涂膜處理能夠明顯延緩雙孢蘑菇采后貯藏過程中感官品質(zhì)的下降。

2.2 不同涂膜處理對雙孢蘑菇貯藏期間失重率和開傘率的影響

失水是造成雙孢蘑菇失重的首要原因之一，會造成雙孢蘑菇萎蔫，影響蘑菇貯藏品質(zhì)。開傘是雙孢蘑菇衰老的一個重要指標[19]。不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間失重率和開傘率的影響見圖2。

圖2 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間失重率和開傘率的影響Fig.2 Effects of different coating treatments on weight loss and the cap opening ratio of A.bisporus during postharvest storage

由圖2可知，各處理組失重率和開傘率均隨著貯藏時間的延長而逐漸上升。貯藏6 d時，抑菌劑復(fù)合涂膜組的失重率和開傘率均小于其它兩組，在第2天時對照組和復(fù)合涂膜組開始出現(xiàn)開傘，而抑菌劑復(fù)合涂膜組在第3天才開始出現(xiàn)開傘，并且在第5天的開傘率顯著低于其它兩組（P＜0.05），分別是對照組和復(fù)合涂膜組的73.7%和77.8%。結(jié)果說明抑菌劑復(fù)合涂膜處理可以在一定程度上抑制雙孢蘑菇的失重率和開傘率的升高，從而延長雙孢蘑菇的貯藏保鮮期。

2.3 不同涂膜處理對雙孢蘑菇貯藏期間硬度和呼吸速率的影響

不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間硬度和呼吸速率的影響見圖3。

圖3 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間硬度和呼吸速率的影響Fig.3 Effects of different coating treatments on hardness and respiration rate of A.bisporus during postharvest storage

硬度是反映雙孢蘑菇品質(zhì)的重要參數(shù)[20]。由圖3A可知，貯藏6 d中3組雙孢蘑菇的硬度均整體呈下降趨勢。抑菌劑復(fù)合涂膜組的硬度整體高于對照組，貯藏前3 d顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏第1天時的硬度是對照組的1.20倍?？傮w來看，抑菌劑復(fù)合涂膜組與復(fù)合涂膜組在硬度上差異不顯著（P＞0.05），僅在貯藏第1天和第4天略高于復(fù)合涂膜組，但兩組的硬度均在貯藏前期顯著高于對照組（P＜0.05），說明抑菌劑復(fù)合涂膜處理能夠有效抑制雙孢蘑菇硬度的下降。

呼吸作用雖然為雙孢蘑菇提供正常生命活動所必需的能量，但同時也消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，造成雙孢蘑菇品質(zhì)下降，是判斷子實體衰老的重要指標之一。如圖3B所示，貯藏6 d中，抑菌劑復(fù)合涂膜組的呼吸速率均低于對照組。其中貯藏第2天時，抑菌劑復(fù)合涂膜組與其它兩組差異明顯，其呼吸速率分別是復(fù)合涂膜組、對照組的59.6%和43.3%。該結(jié)果表明抑菌劑復(fù)合涂膜處理可抑制雙孢蘑菇采后貯藏中呼吸速率的上升。謝雯君等[21]也發(fā)現(xiàn)涂膜處理能夠抑制子實體呼吸作用，延長雙孢蘑菇的保鮮品質(zhì)。

2.4 不同涂膜處理對雙孢蘑菇貯藏期間可溶性蛋白和MDA含量的影響

不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間可溶性蛋白和MDA的影響見圖4。

圖4 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間可溶性蛋白和MDA的影響Fig.4 Effects of different coating treatments on soluble protein and MDA of A.bisporus during postharvest storage

雙孢蘑菇的貯藏品質(zhì)與可溶性蛋白含量有著密切聯(lián)系，可溶性蛋白含量越多，細胞膜的穩(wěn)定性越強，雙孢蘑菇子實體的抗性越高[22]。由圖4A可知，抑菌劑復(fù)合涂膜組和復(fù)合涂膜組在整個貯藏過程均抑制了可溶性蛋白含量的下降，其中抑菌劑復(fù)合涂膜組抑制效果更明顯。貯藏第2天，抑菌劑復(fù)合涂膜組的可溶性蛋白含量是對照組的1.21倍，是復(fù)合涂膜組的1.07倍，這說明抑菌劑復(fù)合涂膜處理可有效抑制采后雙孢蘑菇子實體內(nèi)可溶性蛋白的降解。

MDA是膜脂過氧化的主要分解產(chǎn)物，其含量反映了植物體內(nèi)細胞所受傷害的嚴重性，MDA越高，說明雙孢蘑菇細胞受到的傷害越嚴重[23]。由圖4 B可知，隨著貯藏時間的延長，3組樣品MDA含量均呈現(xiàn)整體增長的趨勢，而抑菌劑復(fù)合涂膜組的MDA含量整體低于對照組和復(fù)合涂膜組。第6天的抑菌劑復(fù)合涂膜組的MDA含量與其它兩組差異顯著（P＜0.05），分別是對照組、復(fù)合涂膜組的70.7%、74.6%，說明抑菌劑復(fù)合涂膜處理可以延緩MDA的積累，從而抑制雙孢蘑菇的膜脂過氧化。

2.5 不同涂膜處理對雙孢蘑菇貯藏期間L*值、BI值、△E值和PPO酶活的影響

不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間L*值、BI值、△E值和PPO酶活的影響見圖5。

圖5 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間L*值、BI值、ΔE值和PPO酶活的影響Fig.5 Effects of different coating treatments on L*，BI and ΔE value and PPO activity of A.bisporus during postharvest storage

酚類物質(zhì)在氧氣和多酚類氧化酶的相互作用下，被氧化成醌類物質(zhì)，是導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要原因[24]。由圖5A可知，3組樣品的L*值均隨著貯藏時間的延長逐漸降低，在3 d～6 d抑菌劑復(fù)合涂膜組的L*值顯著高于對照組（P＜0.05），最高達對照組的1.03倍。由圖5B和圖5C可知，BI值和△E值隨著貯藏時間的延長逐漸增大。在整個貯藏期間，對照組的BI值和△E值均高于復(fù)合涂膜組和抑菌劑復(fù)合涂膜組。第6天時，對照組的BI值分別為復(fù)合涂膜組和抑菌劑復(fù)合涂膜組的1.09倍和1.13倍。貯藏第4天，抑菌劑復(fù)合涂膜組的△E值為對照組的30.2%。從整體來看，復(fù)合涂膜組和抑菌劑復(fù)合涂膜組在整個貯藏期間的L*值、BI值、△E值無明顯差異。由圖5D可知，對照組PPO酶活在貯藏過程中整體呈上升趨勢，抑菌劑復(fù)合涂膜組和復(fù)合涂膜組的PPO酶活在整個貯藏期間均低于對照組，尤其在第5天，抑菌劑復(fù)合涂膜組的PPO酶活僅為對照組的71.9%，說明抑菌劑復(fù)合涂膜處理能抑制雙孢蘑菇貯藏中PPO酶活增加。以上結(jié)果說明，抑菌劑復(fù)合涂膜處理可以有效地抑制雙孢蘑菇褐變，使其更好地維持保鮮品質(zhì)。

2.6 不同涂膜處理對雙孢蘑菇貯藏期間抗氧化相關(guān)酶活性的影響

SOD、POD和CAT是主要的抗氧化酶，能夠消除雙孢蘑菇子實體內(nèi)活性氧的積累[25]。不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間SOD、POD和CAT酶活的影響見圖6。

圖6 不同涂膜處理對采后雙孢蘑菇貯藏期間SOD、POD和CAT酶活的影響Fig.6 Effects of different coating treatments on SOD，POD and CAT activities of A.bisporus during postharvest storage

由圖6A可知，3組處理的SOD酶活均呈先上升后下降，繼而再上升又下降的趨勢。與對照組相比，抑菌劑復(fù)合涂膜組和復(fù)合涂膜組均明顯促進了SOD酶活的上升，尤其貯藏后4 d抑菌劑復(fù)合涂膜組的SOD酶活均高于其它組。第3天抑菌劑復(fù)合涂膜組的SOD酶活是復(fù)合涂膜組的1.18倍，是對照組的1.59倍。由圖6B可知，雙孢蘑菇中POD酶活呈現(xiàn)波動上升的趨勢。各處理組中，抑菌劑復(fù)合涂膜組的POD酶活在貯藏后4 d高于其它組，3 d～6 d顯著高于對照組（P＜0.05），第6天時的POD酶活分別是復(fù)合涂膜組和對照組的1.96倍和2.21倍。由圖6 C可以看出，3組樣品的CAT酶活均呈先下降后上升繼而再下降又上升的趨勢。整個貯藏期間，抑菌劑復(fù)合涂膜處理對CAT酶活的上升沒有顯著誘導(dǎo)效果，僅在貯藏第3天，該組的CAT酶活與復(fù)合涂膜組和對照組的差異顯著（P＜0.05），分別是復(fù)合涂膜組和對照組的1.09倍和1.27倍。以上結(jié)果表明，抑菌劑復(fù)合涂膜處理可以明顯增強SOD、POD、CAT三種抗氧化酶的活性，有利于提高雙孢蘑菇采后貯藏期間的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗將涂膜保鮮法與抑菌劑相結(jié)合，對雙孢蘑菇進行不同的涂膜處理。結(jié)果顯示，抑菌劑復(fù)合涂膜處理不僅有效抑制雙孢蘑菇的失重率、呼吸速率和開傘率的上升，同時也有效地延緩了硬度的下降、可溶性蛋白的降解以及抑制多酚氧化酶的活性，從而減輕了褐變現(xiàn)象。此外，抑菌劑復(fù)合涂膜處理還可以增強雙孢蘑菇中抗氧化物酶活，降低膜脂過氧化產(chǎn)物在子實體內(nèi)的積累。通過以上結(jié)果可以得出，抑菌劑復(fù)合涂膜處理能夠有效維持采后雙孢蘑菇品質(zhì)，有利于雙孢蘑菇采后貯藏的保鮮，在食用菌保鮮領(lǐng)域有一定的實用價值，具有廣闊的發(fā)展前景。