萬莉，鄧曉風(fēng)，畢媛媛，唐玲，代青

（貴州省貴陽市第二人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550081）

0 引言

自然流產(chǎn)的致病機理較多，胎停育、解剖因素、內(nèi)分泌因素、遺傳因素等多種原因均可引發(fā)。針對既往有過胎停育和自然流產(chǎn)史者，應(yīng)在下次懷孕前找到病因，以防范可能存在的風(fēng)險。常規(guī)電化學(xué)發(fā)光內(nèi)分泌和抗胚胎抗體、陰道鏡、動態(tài)數(shù)字化子宮輸卵管造影、陰道四維彩超等均有助于了解宮腔形態(tài)。為進一步提升臨床檢查成效，擬定采用動物實驗?zāi)Ｐ鸵赃M一步提升臨床效果，為改善患者預(yù)后提供有效借鑒[1,2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的四氯化碳暴露誘導(dǎo)體外實驗的研究，通過構(gòu)筑小鼠實驗?zāi)Ｐ?，以此達到較佳的臨床效果[3-5]。現(xiàn)就內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的四氯化碳暴露誘導(dǎo)小鼠蛻膜細胞表面CRT表面異常表達分析如下。

1 研究內(nèi)容和方法

1.1 一般材料

利用四氯化碳建立小鼠蛻膜細胞變性模型，使用體積分數(shù)為10%的四氯化碳橄欖油溶液給小鼠腹腔注射，連續(xù)注射三天?？偣卜譃樗慕M小鼠，每組六只，其中一組為對照組。每注射完24h后處死一組外加兩只對照組。

1.2 方法

應(yīng)用體外實驗，采用Western Blotting技術(shù)，研究四氯化碳暴露引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)小鼠蛻膜細胞表面CRT異常表達進而抑制血管生成，最后促進流產(chǎn)發(fā)生的分子機制。將妊娠期小鼠進行四氯化碳處理后，將小鼠分為對照組及實驗組，利用qRT-PCR、Western Blotting、流式細胞術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞CRT表達情況；通過合成si-CRT并轉(zhuǎn)染至小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞以檢測CRT mRNA及蛋白表達量，同時運用qPCR技術(shù)來研究抑制CRT表達后對蛻膜血管生成的影響。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立——篩選四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4）刺激濃度：（1）將小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞按5×10 5個細胞量鋪于96孔板中，待狀態(tài)穩(wěn)定后棄去上清；（2）將CCL4按0、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L濃度梯度加入細胞中，并設(shè)置多個復(fù)孔；（3）待藥物刺激細胞12h后，加入200μl/孔MTT于細胞中，37℃恒溫箱避光孵育4h；（4）棄去上清，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，置于多功能熒光酶標儀，在測定波長490nm處測定光吸收值（optical density，OD值）；（5）測得OD值求平均值后，繪制細胞生存曲線。

一般方法：（1）合成并檢測si-CRT的表達：①在文獻中查找si-CRT序列；②將si-CRT序列轉(zhuǎn)染后檢測CRT mRNA及蛋白表達量檢測；（2）qPCR檢測si-CRT轉(zhuǎn)染至小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞后CRT的表達；（3）Western Blotting檢測si-CRT轉(zhuǎn)染至小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞后CRT的表達。（4）研究抑制CRT表達對小鼠蛻膜血管的影響：①在6孔板中，將si-CRT轉(zhuǎn)染至小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞并培養(yǎng)24h；②收集細胞，通過qRT-PCR檢測蛻膜組織血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGFR-2、sVEGFR-1的表達的含量：采用TRlzol法抽提蛻膜組織中總RNA，測定RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以β-actin為內(nèi)參，按照引物序列進行PCR擴增，擴增條件為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性5s，60℃退火延伸10s，40個循環(huán)，在用多元定量PCR儀上反應(yīng)，采用△△C（t）計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的四氯化碳暴露誘導(dǎo)小鼠蛻膜細胞表面CRT表面異常表達，其分子機理可能為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后促進CRT轉(zhuǎn)錄因子的表達與活化，CRT水平在細胞核內(nèi)參與生脂相關(guān)酶如VEGF水平等基因的誘導(dǎo)表達，四氯化碳暴露引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)小鼠蛻膜細胞表面CRT異常表達進而抑制血管生成，最后促進流產(chǎn)發(fā)生。

3 討論

ART助孕后及正常妊娠后稽留流產(chǎn)患者蛻膜組織中CRT表達較正常妊娠患者蛻膜中增加，流產(chǎn)患者蛻膜組織中CRT與IAP含量存在負相關(guān)關(guān)系，可能存在某種機制調(diào)節(jié)二者在蛻膜組織中的表達，共同作用母-胎界面上母體細胞穩(wěn)定的維持；CRT在蛻膜細胞中均呈陽性表達，均位于細胞漿及胞膜[6-10]。ART稽留流產(chǎn)組和自然妊娠稽留流產(chǎn)組CRT表達。蛻膜組織中CRT的異常表達,可能對稽留流產(chǎn)進程發(fā)揮著重要作用；Western Blotting檢測患者蛻膜組織中CRT表達極顯著升高，CRT在蛻膜組織中定位于細胞漿及胞膜呈陽性表達；稽留流產(chǎn)組患者蛻膜組織中CRT的積分光密度值水平。早期先兆流產(chǎn)的發(fā)生可能與CRT在絨毛和蛻膜組織中的高表達并介導(dǎo)凋亡相關(guān)；CRT陽性信號定位于絨毛兩層滋養(yǎng)層細胞的胞質(zhì)和胞膜上。CRT 在自然流產(chǎn)者蛻膜和絨毛細胞中表達上調(diào)，與自然流產(chǎn)的眾多因素密切相關(guān)，但二者之間的關(guān)系尚待深入研究。CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合蛋白,作為一種多功能的分子伴侶,CRT參與了細胞多種生理功能的調(diào)節(jié),并參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展進程,如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和自身免疫疾病。CRT及Caspase-3在早期自然流產(chǎn)蛻膜及絨毛組織中表達高于正常早孕組；稽留流產(chǎn)組蛻膜及絨毛組織中CRT及Caspase-3的表達均高于先兆流產(chǎn)組；CRT與Caspase-3呈正相關(guān)。CRT及Caspase-3異常表達可能參與ESA的發(fā)生機制,高表達的CRT也可作為判斷是否有自然流產(chǎn)危險的標志之一[11-15]。在妊娠中，胎盤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激與抗氧化防御系統(tǒng)保持著動態(tài)平衡。當(dāng)氧化應(yīng)激的程度超過防御系統(tǒng)的抵抗力或者抗氧化系統(tǒng)的功能出現(xiàn)障礙時，會誘發(fā)過度的氧化應(yīng)激，進而高活性分子增多并不能被有效清除，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微環(huán)境的改變。近來研究表明，在自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中，細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，大量錯誤折疊或未折疊的蛋白堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，此時對分子伴侶的需求量增加，CRT的合成也相應(yīng)增加，CRT的vasostatin片段會抑制內(nèi)皮細胞的增生，使得新生血管無法生成，抑制蛻膜血管的重建，從而引起自然流產(chǎn)。

基于此，在妊娠中，胎盤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激與抗氧化防御系統(tǒng)保持著動態(tài)平衡。當(dāng)氧化應(yīng)激的程度超過防御系統(tǒng)的抵抗力或者抗氧化系統(tǒng)的功能出現(xiàn)障礙時，會誘發(fā)過度的氧化應(yīng)激，進而高活性分子增多并不能被有效清除，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微環(huán)境的改變。CRT的合成也相應(yīng)增加，CRT的vasostatin片段會抑制內(nèi)皮細胞的增生，使得新生血管無法生成，抑制蛻膜血管的重建，從而引起自然流產(chǎn)。據(jù)此研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)CRT異常表達，從而抑制蛻膜血管生成并引起流產(chǎn)的作用機制至關(guān)重要，具有良好的理論依據(jù)。從妊娠過程中外界因素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激異常調(diào)控，并誘導(dǎo)蛻膜組織CRT表達異常進而抑制蛻膜血管生成引發(fā)流產(chǎn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)CRT高表達在自然流產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促發(fā)相關(guān)細胞死亡途徑而導(dǎo)致CRT異常表達增高最終導(dǎo)致流產(chǎn)；VEGF是血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子，在早期妊娠中起著至關(guān)重要的作用[16,17]。通過敲低CRT表達后，研究小鼠蛻膜血管調(diào)節(jié)因子的表達情況。

CRT是分子量為46.6KD的結(jié)構(gòu)和功能上都高度保守的鈣離子結(jié)合蛋白，主要存在于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及胞漿和胞膜上。CRT分為N-末端區(qū)、P區(qū)、C-末端區(qū)三個結(jié)構(gòu)和功能區(qū)。N-末端區(qū)含有180個氨基酸殘基（1-180），序列最為保守，有球狀的β-折疊篇，是CRT的分子伴侶功能區(qū)。P區(qū)（181-280氨基酸殘基）富含脯氨酸，由兩條發(fā)卡結(jié)構(gòu)的β-折疊篇構(gòu)成，是具有低容量和高親和力特性的鈣結(jié)合位點。C-末端含有作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的四肽賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸，即KDEL序列，可以引導(dǎo)CRT的靶向定位并且參與鈣離子的儲存 ，鈣離子紊亂的情況下會阻礙胚泡的發(fā)生發(fā)育，并且ER-CRT-Ca2+穩(wěn)態(tài)對于卵母細胞的成熟和胚胎的發(fā)育起著非常重要的作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動，需要大量的CRT去修正錯誤折疊和未折疊的在腔內(nèi)聚集的蛋白并且調(diào)節(jié)鈣離子的平衡。在正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以激活CRT內(nèi)分子伴侶的表達及其他保護機制來抵制應(yīng)激作用，從而起到保護細胞的作用。然而，當(dāng)細胞處于過度或者長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時，其保護機制無法抗衡損傷，便會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細胞死亡途徑，此時表現(xiàn)出過度凋亡，阻止了胚胎的進一步發(fā)育，誘發(fā)先兆流產(chǎn)。在胚胎發(fā)育早期，血管新生是胚胎植入和子宮內(nèi)膜發(fā)育最基本的條件。VEGF是一種作用于血管內(nèi)皮細胞的多功能細胞因子及血管生成最重要的調(diào)整因子，一方面能促進血管內(nèi)皮細胞及滋養(yǎng)細胞的分裂和遷移，促進新生血管的形成，另一方面可以調(diào)節(jié)血管的通透性，在受精、胚胎著床、胎盤血管的形成及胎兒生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。多年前已有學(xué)者指出子宮內(nèi)膜血管形成異常與自然流產(chǎn)中VEGF表達較正常早期妊娠明顯降低，這可能與CRT高表達有關(guān)。在自然流產(chǎn)蛻膜組織中，細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中急需折疊，因而對分子伴侶的需求增加，CRT的合成也相應(yīng)增加，CRT的N端結(jié)構(gòu)域1-180位氨基酸片段即vasostain片段作為一種血管生成抑制因子，可以有效專一地抑制內(nèi)皮細胞的增生，從而使得新生血管無法形成，抑制蛻膜血管的重建，最終引發(fā)自然流產(chǎn)。在早期妊娠中CRT可以通過抑制血管生成而導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。不良狀態(tài)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、CRT的異常表達及蛻膜組織血管的異常形成皆與自然流產(chǎn)存在一定聯(lián)系，但三者之間的聯(lián)系及引起自然流產(chǎn)的作用機制仍是研究的難點和熱點。因此我們提出一下科學(xué)假設(shè)：通過對妊娠期小鼠進行CCL4處理后，觀察小鼠胎盤生長發(fā)育及其病理變化，并在體外實驗中研究這種刺激是否會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過表達進而誘導(dǎo)CRT表達異常并且抑制蛻膜血管生成，最終引起流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述，小鼠蛻膜細胞表面CRT表面異常表達受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的四氯化碳暴露誘導(dǎo)效應(yīng)增加影響，可作為自然流產(chǎn)患者臨床疾病概況的預(yù)期方式，以此達到較佳的效果。