2-乙?；锘ㄌ擒湛蛊乒羌?xì)胞形成及其作用機(jī)制△

韓曉玲，楊云，韋秋，蔡銘琪，毛浩萍

天津中醫(yī)藥大學(xué) 方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617

骨組織生命活動(dòng)周期包括成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，這一過程被稱為骨重塑。在骨重塑過程中，骨吸收水平大于骨形成水平時(shí)會(huì)使骨質(zhì)減少從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）。OP 是最常見的骨重塑疾病之一，其特點(diǎn)是骨量降低，骨折風(fēng)險(xiǎn)升高。研究顯示，OP在發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折之前大多是隱秘不被發(fā)覺的，因此被稱為“沉默的殺手”[1]。

目前臨床治療OP的藥物，主要包括抑制破骨細(xì)胞吸收藥物如雌激素、降鈣素類及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，以及促進(jìn)骨形成藥物如特立帕肽等。然而上述療法或藥物在發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松藥效的同時(shí)還帶來骨肉瘤等風(fēng)險(xiǎn)，從而限制了其使用。干細(xì)胞移植治療雖然為OP 防治開辟了新方向[2]，但在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍不成熟[3]，其有效性仍存有爭議。因此中醫(yī)藥治療OP成為新的研究方向。

2-乙?；锘ㄌ擒帐莵碓从谌馍惾刂械囊环N苯乙醇苷類物質(zhì)（圖1）[4]。現(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有較好的抗OP作用，促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合[5-8]。2-乙酰基毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉中代表性化合物，被證明具有抗炎作用[9]，而炎癥無論在破骨細(xì)胞形成還是OP的病理生理發(fā)展過程中均扮演著極其重要的角色。本研究采用原代培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞，檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)單個(gè)核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及其對(duì)骨吸收功能的影響，以期闡明2-乙?；锘ㄌ擒帐侨馍惾匕l(fā)揮抗OP作用的有效物質(zhì)及其可能的作用機(jī)制。

圖1 2-乙?；锘ㄌ擒盏幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體（SPF）級(jí)4 周齡C57BL/6J 雌性小鼠10 只，購于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（京）2016-0002，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)為TCM-LAEC2021156。

1.2 試藥

對(duì)照品2-乙?；锘ㄌ擒眨ㄅ?hào)：SA8050，純度≥98%）、RIPA裂解液（批號(hào)：20180615）、苯甲基磺酰氟（PMSF，批號(hào)：20210930）、三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBS，批號(hào)：20181011）、曲拉通（批號(hào)：301G056）、紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)：20220908）均購于北京索萊寶生物科技有限公司；青霉素及鏈霉素雙抗（批號(hào)：1950172）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：0062819）均購于Biological Industries公司；胎牛血清（批號(hào)：04257，Ausbian公司）；Ficoll細(xì)胞分離液（批號(hào)：10272519，GE公司）；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF，批號(hào)：W220014128017-21060719310003-018）、核轉(zhuǎn)錄因子-кB 受體活化因子配體（RANKL，批號(hào)：W220014945000-210624173210036-001）均購于美國R&D 公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（批號(hào)：04124，Sigma 公司）；TRAP 活性檢測試劑盒（批號(hào)：042821220519）、BCA 蛋白檢測試劑盒（批號(hào)：20210102）、DAPI溶液（批號(hào)：C1006）均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；α-MEM培養(yǎng)基（批號(hào)：2105319）、Alex-Fluor 568 標(biāo)記Factin（批號(hào)：HY1126）均購于賽默飛世爾科技公司；細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒（CCK8，批號(hào)：22145325，Biosharp 公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）抗體（批號(hào)：GR3352902-4）、原癌基因c-Fos抗體（批號(hào)：GR3212874-1）均購于Abcam 公司；β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)：UM4001，天津優(yōu)抗生物技術(shù)有限公司）；整合素β3（ITGβ3）抗體（批號(hào)：HN0810，Novus Biologicals公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（批號(hào)：127917，北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.3 儀器

SPARK 型多功能酶標(biāo)儀（TECAN 公司)；TS2-S-SM 型倒置顯微鏡（Nikon公司）；552BR066646型電泳槽、221BR 52209型半干轉(zhuǎn)、734BR4251型超靈敏多功能成像儀均購自Bio-Rad 公司；KB-900 型脫色搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠單個(gè)核細(xì)胞分離培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min。迅速分離出小鼠雙側(cè)脛骨與股骨浸泡在含10%雙抗的PBS液中。徹底分離肌肉組織后，用1 mL 注射器吹出骨髓組織，充分吹散后收集細(xì)胞液。使用75 μm細(xì)胞濾器將單個(gè)細(xì)胞收集至50 mL 無菌離心管中。隨后使用Ficoll細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞于250×g離心10 min 后使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，清洗細(xì)胞2遍，得到單個(gè)核細(xì)胞。

2.2 破骨前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)

單個(gè)核細(xì)胞用提前預(yù)熱的含25 ng·mL-1M-CSF的完全培養(yǎng)基（α-MEM+10%胎牛血清+1%雙抗）中重懸，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)過夜，非貼壁細(xì)胞即為破骨前體細(xì)胞。

收集破骨前體細(xì)胞，在M-CSF（25 ng·mL-1）和RANKL（50 ng·mL-1）條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d，即為破骨細(xì)胞。

2.3 CCK8 法檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨前體細(xì)胞活性的影響

單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)在含25 ng·mL-1M-CSF 的完全培養(yǎng)基中，密度為3×105個(gè)/孔。48 h后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組（含25 ng·mL-1M-CSF 的完全培養(yǎng)液）和不同濃度2-乙?；锘ㄌ擒战o藥組（25 ng·mL-1M-CSF 中分別加0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒盏耐耆囵B(yǎng)液）干預(yù)7 d，每3 d 換1次培養(yǎng)液。最后1 d 加入含10% CCK8 溶液的完全培養(yǎng)液，37 ℃孵育2 h 后在450 nm 處檢測吸光度（A）值，按公式（1）計(jì)算細(xì)胞活力。

式中A給藥組表示具有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度值；A空白組表示具有培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，沒有細(xì)胞的孔的吸光度值；A對(duì)照組表示具有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，沒有藥物溶液的孔的吸光度值。

2.4 TRAP染色及TRAP活性檢測

為研究2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨細(xì)胞分化的影響，采用25 ng·mL-1M-CSF 和50 ng·mL-1RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（含25 ng·mL-1M-CSF 的完全培養(yǎng)液）、模型組（含25 ng·mL-1M-CSF 和50 ng·mL-1RANKL的完全培養(yǎng)液）、不同濃度2-乙?；锘ㄌ擒战o藥組（25 ng·mL-1M-CSF 和50 ng·mL-1RANKL 中分別含0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒盏耐耆囵B(yǎng)液），干預(yù)7 d，每3 d換1次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)為成熟的破骨細(xì)胞。隨后用TRAP活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞上清液中TRAP活性。用PBS潤洗細(xì)胞2次，于4%多聚甲醛中固定15 min，利用TRAP染色試劑盒進(jìn)行TRAP染色。使用倒置顯微鏡拍攝染色圖像。

2.5 F-actin環(huán)染色

按2.4 項(xiàng)下方法分組，將破骨前體細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的破骨細(xì)胞后，棄去上清液。4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，采用含0.1%曲拉通的PBS 對(duì)細(xì)胞透化。PBS 潤洗細(xì)胞并加入Alex-Fluor 568 標(biāo)記的Factin 染料，37 ℃孵育40 min。再次洗滌細(xì)胞后，DAPI復(fù)染10 min。洗滌細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，采集圖像后采用Image Pro 6.0分析圖像。

2.6 骨陷窩形成實(shí)驗(yàn)

將破骨前體細(xì)胞接種于放有骨切片的培養(yǎng)板中，按2.4 項(xiàng)下方法分組培養(yǎng)細(xì)胞，7 d 后采用次氯酸鈉溶液除去涂層板上的細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察骨吸收程度，獲得骨吸收?qǐng)D像并用Image Pro 6.0分析圖像。

2.7 蛋白印跡法（Western blot，WB）分析

6 孔板中培養(yǎng)破骨細(xì)胞，吸棄細(xì)胞上清液，采用預(yù)冷的PBS 潤洗1 次。按60 μL/孔加入RIPA 和PMSF（100∶1），在冰上裂解總蛋白15 min。將懸浮液在4 ℃，15 000×g離心10 min，上清液收集至新的離心管中即為總蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。加入適量的上樣緩沖液，在100 ℃煮沸5 min。接著使用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)（總蛋白40 μg/孔），60 V 電泳30 min、120 V電泳60 min，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用TBST 稀釋（1∶1000）兔多克隆抗體ITGβ3、c-Fos、TRAP 在4 ℃孵育過夜。次日，將膜在TBST 中清洗3 次（5 min/次），接著與相應(yīng)的二抗（1∶10 000）在室溫條件下孵育2 h。最后加化學(xué)發(fā)光底液顯影檢測，采用Image Pro 6.0分析圖像。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（xˉ±s）表示。多組定量選用單因素方差分析。采用GraphPrism 7進(jìn)行作圖處理。

3 結(jié)果

3.1 2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨細(xì)胞分化的影響

M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞聚集融合形成具有多核形態(tài)的TRAP 染色陽性細(xì)胞（圖2），提示模型組中破骨細(xì)胞形成增多。給予0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒? d后，TRAP陽性染色多個(gè)核細(xì)胞數(shù)量減少，且細(xì)胞形態(tài)明顯變小。進(jìn)一步采用TRAP 活性檢測試劑盒對(duì)各組細(xì)胞酶活性進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)分化模型組細(xì)胞TRAP 酶活性顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒站茱@著抑制M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)TRAP 酶活性的增加（P＜0.05），提示2-乙?；锘ㄌ擒站哂幸种破乒羌?xì)胞形成的作用。

圖2 破骨細(xì)胞TRAP染色圖

圖3 破骨前體細(xì)胞TRAP活性（,n=5）

3.2 2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨前體細(xì)胞的影響

破骨前體細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，與對(duì)照組相比，0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨前體細(xì)胞活性無顯著影響。提示2-乙?；锘ㄌ擒找种破乒羌?xì)胞形成并非是由于其抑制破骨前體細(xì)胞活性產(chǎn)生的。

圖4 破骨前體細(xì)胞的細(xì)胞活力（,n=6）

3.3 2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)骨吸收功能的影響

通常破骨細(xì)胞只有形成閉合F-actin環(huán)才具有骨吸收功能，因此，繼續(xù)采用F-actin染色來檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響（圖5～6）。與對(duì)照相比，模型組F-actin環(huán)數(shù)量及面積顯著增加，而0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒找种芃-CSF和RANKL 誘導(dǎo)的F-actin 環(huán)的形成。進(jìn)一步采用骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)確證2-乙?；锘ㄌ擒盏目构俏展δ?，發(fā)現(xiàn)模型組骨吸收陷窩數(shù)量增多，而0.1、1.0、10.0 μmol·L-1的2-乙?；锘ㄌ擒诊@著減少破骨細(xì)胞骨吸收形成的骨陷窩面積。

圖5 破骨細(xì)胞的F-actin染色和骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)結(jié)果（100×）

3.4 2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)破骨細(xì)胞形成特異性指標(biāo)蛋白TRAP、ITGβ3、c-Fos蛋白表達(dá)的影響

WB 檢測2-乙酰基毛蕊花糖苷對(duì)破骨細(xì)胞形成特異性指標(biāo)蛋白的影響，結(jié)果見圖7～8。與對(duì)照組相比，模型組破骨細(xì)胞形成特異性指標(biāo)蛋白TRAP、ITGβ3和c-Fos 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒崭深A(yù)后可顯著降低ITGβ3、TRAP、c-Fos蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 2-乙?；锘ㄌ擒湛蛊乒羌?xì)胞骨吸收功能的影響（,n=3）

圖7 破骨細(xì)胞WB結(jié)果圖

4 討論

人的一生中，骨組織一直處于由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和骨形成的骨重建過程。隨著骨重建的發(fā)生，骨形成大于骨吸收，從而人體骨骼得以生長。隨著衰老的發(fā)生或體內(nèi)激素水平的變化，出現(xiàn)骨吸收與骨形成之間失衡狀態(tài)，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成，從而出現(xiàn)骨量減少，最終形成OP[10]。因此，抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收或促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成成為抗OP藥物研發(fā)的兩個(gè)重要方向。其中，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收功能異常在骨重塑過程中起著關(guān)鍵作用。因此，從抑制破骨細(xì)胞形成及功能角度出發(fā)，研究具有抗破骨細(xì)胞形成的藥物對(duì)抗OP藥物的研發(fā)具有重要意義[10]。本研究發(fā)現(xiàn)2-乙酰基毛蕊花糖苷在對(duì)破骨前體細(xì)胞活性未見顯著影響的前提下，具有顯著抑制M-CSF 和RANKL 共同誘導(dǎo)的細(xì)胞TRAP 酶活性的增加，減少多個(gè)核細(xì)胞形成的作用，提示2-乙?；锘ㄌ擒站哂酗@著的抗破骨細(xì)胞形成作用。此外，骨陷窩實(shí)驗(yàn)表明2-乙?；锘ㄌ擒者M(jìn)一步抑制破骨細(xì)胞功能。臨床上絕經(jīng)期OP、牙周病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性骨髓瘤等骨代謝性疾病均與破骨細(xì)胞的過度活躍密切相關(guān)[11-13]，提示2-乙?；锘ㄌ擒湛梢宰鳛樯鲜銎乒羌?xì)胞過度活性相關(guān)疾病的潛在藥物進(jìn)行深入研究。

圖8 2-乙?；锘ㄌ擒諏?duì)TRAP、ITGβ3、c-Fos蛋白表達(dá)的影響（,n=3）

破骨細(xì)胞由骨髓中單個(gè)核細(xì)胞在M-CSF 和RANKL 共同作用下，相互融合形成巨大的多核細(xì)胞，即成熟的破骨細(xì)胞。在破骨細(xì)胞分化過程中，細(xì)胞骨架F-actin 形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以封閉下方區(qū)域并形成一個(gè)封閉的空間，其中通過吸收骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)產(chǎn)生吸收坑[14]。因此，骨陷窩的形成被認(rèn)為是破骨細(xì)胞的典型標(biāo)志[15]。因此，筆者研究2-乙酰基毛蕊花糖苷對(duì)F-actin 環(huán)的形成和骨吸收的影響，結(jié)果表明RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞產(chǎn)生更多的F-actin環(huán)和骨吸收坑，具有更強(qiáng)的骨吸收功能，這些特征可顯著被2-乙?；锘ㄌ擒找种?。成熟的破骨細(xì)胞附著于骨骼表面，高表達(dá)TRAP 行使骨吸收功能[16]。本研究結(jié)果顯示2-乙?；锘ㄌ擒诊@著抑制破骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞TRAP 活性，抑制細(xì)胞內(nèi)TRAP 蛋白表達(dá)，表現(xiàn)出對(duì)破骨細(xì)胞活性較強(qiáng)的抑制作用。整合素蛋白家族是一組細(xì)胞表面的黏附分子，由α、β2條鏈（或亞單位）經(jīng)非共價(jià)鍵連接組成的異二聚體，與相鄰細(xì)胞上的特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或受體結(jié)合，參與調(diào)控包括增殖、存活、遷移及分化等多方面的細(xì)胞行為。ITGβ3是整合素家族中的一種亞單位，ITGβ3亞單位與αⅡb配對(duì)形成αⅡbβ3與纖維蛋白原和血管性血友病因子結(jié)合，在止血和血栓形成過程中介導(dǎo)血小板聚集[17]。ITGβ3亞單位還可與αⅤ結(jié)合形成αβ3，在破骨細(xì)胞中高度表達(dá)，參與破骨細(xì)胞形成[18]。因此，ITGβ3也被當(dāng)成一個(gè)破骨細(xì)胞標(biāo)志物而被廣泛應(yīng)用于破骨細(xì)胞形成相關(guān)研究中[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中ITGβ3蛋白表達(dá)增加，而2-乙酰基毛蕊花糖苷顯著抑制ITGβ3蛋白表達(dá)，與其抑制TRAP 蛋白及其酶活性結(jié)果一致。c-Fos 屬于Fos 轉(zhuǎn)錄因子家族，由位于染色體14 上的c-Fos 基因編碼。c-Fos 與c-Jun 異源二聚形成激活蛋白-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化中起重要作用的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，也參與了破骨細(xì)胞分化過程[20-21]。從本研究蛋白結(jié)果我們可以看出，2-乙?；锘ㄌ擒漳苷{(diào)節(jié)c-Fos 蛋白含量，這可能是其抑制破骨細(xì)胞分化的潛在作用途徑。

隨著人口老齡化程度日益加重，我國OP 的防治形勢日益嚴(yán)峻。骨質(zhì)疏松癥及其嚴(yán)重骨折給個(gè)人、家庭和社會(huì)均帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，為此抗OP藥物的研發(fā)變得尤為重要。近年來，雖然在抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成等方面抗OP 藥物日漸豐富，但是無論是藥物研發(fā)還是臨床抗OP 治療仍存在多方面問題。而中醫(yī)藥長期應(yīng)用于骨科相關(guān)疾病的臨床治療，在治療OP 等慢性疾病方面具有一定優(yōu)勢，本研究以肉蓯蓉中主要有效成分之一2-乙?；锘ㄌ擒諡檠芯繉?duì)象，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗破骨細(xì)胞形成及抗骨吸收的作用，為臨床OP治療藥物的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。