王麗，林昕，魏茂瓊，陳興連，林濤，劉宏程

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，昆明 650205； 2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，昆明 650205)

三七為五加科人參屬多年生草本植物，主要產(chǎn)于云南省文山州等地，是預(yù)防和治療心腦血管等疾病的傳統(tǒng)中藥材之一，有散瘀止血、消腫定痛等功效[1-3]。在三七人工種植過程中，不可避免地會噴施農(nóng)藥來防治各種病蟲草害，可能存在農(nóng)藥使用過量或違規(guī)使用情況，從而導致藥材中藥物殘留明顯，影響用藥者人身安全[4]。因此建立殘留分析技術(shù)對三七等中藥材中農(nóng)藥殘留分析監(jiān)測，對保障人民身體健康及推進中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。氨基甲酸酯和有機磷類等殺蟲劑被廣泛用于中藥材種植中病蟲害防治。目前，對中藥材中氨基甲酸酯類農(nóng)藥分析有一些報道[5-6]，但主要針對農(nóng)藥母體的監(jiān)測，忽略了相關(guān)代謝物殘留的同時分析。研究發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藥代謝物毒性遠高于農(nóng)藥母體[7]，農(nóng)藥及其代謝物的同時監(jiān)測，對食品安全更有意義。筆者選取幾種殺蟲劑類農(nóng)藥：克百威、涕滅威、氟蟲腈、水胺硫磷，對以上農(nóng)藥代謝物同時分析。以上農(nóng)藥在三七等中藥材種植中屬于禁用農(nóng)藥，但可能存在違規(guī)錯誤使用情況，對三七中幾種禁用農(nóng)藥及其代謝物殘留同時分析對中藥材安全性具有重要意義。

中藥材中禁限用農(nóng)藥殘留分析有一些報道[8-9]，但三七中以上幾種禁用農(nóng)藥的研究報道不多。張舉成等[5-6]只測定了三七中幾種氨基甲酸酯中母體農(nóng)藥殘留，沒有代謝物分析，且采用的固相萃取前處理相對復雜、耗時。氟蟲腈及代謝物在三七中的分析鮮少報道。目前，分散固相萃取技術(shù)因其操作快速、簡便等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用在農(nóng)藥殘留分析中[10-12]。在貝母、山海棠有等中藥材的農(nóng)藥分析中有一定應(yīng)用[13-14]，在三七農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用報道相對較少。與傳統(tǒng)色譜方法對比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS/MS)技術(shù)選擇性和靈敏度更好，針對中藥材等復雜樣本的抗基質(zhì)干擾能力更強[15]。筆者以中藥材三七為研究對象，對色譜、質(zhì)譜及分散固相萃取法提取凈化等相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化，建立針對三七中農(nóng)藥及代謝物殘留量的分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時快速檢測方法，為中藥材產(chǎn)品中藥物及代謝物殘留分析提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：5500 型，美國AB SCIEX 公司。

電子分析天平：JJ200 型，感量為10 mg，江蘇省常熟市雙杰測試儀器廠。

超聲波清洗儀：KQ-500DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速離心機：TGL-10B-6D 型，上海安亭科學儀器廠。

超純水儀：MILLI-Q 型，美國密理博公司。

渦旋振蕩器：Vortex3 型，德國艾卡公司。

克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、水胺硫磷、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫化物標準樣品：1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司。

乙酸銨、甲酸、乙酸：色譜純，美國Sigma 公司。

PSA(N-丙基乙二胺)、NH2(丙氨基鍵合硅膠)、C18(十八烷基鍵合硅膠)、弗羅里硅土、GCB(石墨化炭黑)凈化材料：粒徑為50～100 μm，天津艾杰爾公司。三七樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美 國Waters 公 司)；流 動 相：A 相 為甲醇，B 相為5 mmol/L 乙酸銨溶液(含質(zhì)量分數(shù) 為0.05% 的 甲 酸)，流 量 為300 μL/min；梯度 洗 脫 程 序：0～5 min，5% A～95% A，5～8 min，95% A～95% A，8～8.1 min，95% A～5% A，8.1～10 min，5% A；柱溫：40 ℃；進樣體積：1.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜儀

采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，ESI 源下正離子和負離子進行同時掃描；電噴霧電壓：正源為5 500 V，負源為-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：0.227 MPa；霧化氣壓力：0.345 MPa；輔助加熱氣壓力：0.379 MPa。每種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10 種農(nóng)藥的色譜、質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實驗步驟

1.3.1 標準溶液配制

準確吸取克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、水胺硫磷、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫化物標準樣品各1.00 mL，用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL 的標準儲備溶液，用移液管準確移取一定體積上述各儲備標準液，混合并用甲醇稀釋定容，得到混合標準溶液，于低溫避光條件下保存。系列標準工作溶液用甲醇和空白基質(zhì)配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理

稱取2 g(精確至0.01 g)三七粉末試樣放入50 mL 離心管中，之后加入10.0 mL 去離子水，渦旋震蕩1 min 后放置30 min，三七干粉試樣應(yīng)充分浸潤，向離心管內(nèi)加入20.0 mL 乙腈作為提取溶劑，渦旋混合振蕩提取1 min，再加入6.0 g 氯化鈉，劇烈振蕩提取1 min，超聲輔助提取30 min，于8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，取上層清液1 mL 至內(nèi)含40 mg PSA、40 mg NH2、20 mg GCB 凈化離心管中，渦旋振蕩提取20 s，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min 后，取上層清液過0.22 μm 濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 定量方法

采用基質(zhì)匹配的標準曲線外標法進行各農(nóng)藥定量分析。在1.2 儀器工作條件下，將系列濃度的基質(zhì)標準工作溶液上機分析，繪制標準曲線，將待測樣品上機分析，計算農(nóng)藥含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

各種農(nóng)藥的離子化效率以及色譜保留時間受流動相體系的影響較大。分別采用甲醇和乙腈作為流動相中的有機相，考察目標農(nóng)藥色譜分離情況。結(jié)果表明，甲醇作為流動相時10 種農(nóng)藥分離效果更好，所以選擇甲醇作為有機相。由于各農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同，克百威、涕滅威及代謝物等容易在ESI 源正離子電離模式下形成[M+H]+[M+Na]+物質(zhì)離子峰，在流動相中加入適當濃度的酸性物質(zhì)可以促進目標物的正離子化效率。但在氟蟲腈及代謝物的結(jié)構(gòu)中，存在數(shù)目較多的強吸電子基團(F、Cl、CN)，使得分子中的氫質(zhì)子極易失去，易形成負離子，加入乙酸銨等緩沖鹽能夠改善待測組分峰形，在一定程度上能提高目標物的響應(yīng)靈敏度[16]。綜合考慮不同農(nóng)藥的化學性質(zhì)，最終選擇甲醇、5 mmol/L 乙酸銨溶液(含質(zhì)量分數(shù)為0.05%的甲酸)為流動相體系，10 種目標化合物響應(yīng)值和色譜峰形等綜合達到最優(yōu)狀態(tài)。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇在ESI 源的正離子和負離子模式下同時掃描方式。采用針泵直接進樣方式對10 種目標農(nóng)藥(0.1 μg/mL)進行一級質(zhì)譜掃描，獲得穩(wěn)定的母離子準離子峰，然后對其進行二級碎片掃描，獲得目標農(nóng)藥的二級子離子質(zhì)譜信息。篩選2～3 個信號較強的二級碎片離子作為子離子，并在MRM 模式下分別優(yōu)化去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)、毛細管電壓及離子源溫度等質(zhì)譜參數(shù)。定量和定性離子最終選取響應(yīng)強度高并且基質(zhì)干擾小的兩對離子。確定的最優(yōu)質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

2.2 樣品處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑

農(nóng)藥殘留分析多選擇甲醇、乙腈等有機溶劑作為提取試劑。筆者采用加標回收法對提取試劑選擇優(yōu)化，以甲醇作為提取劑時共提取的干擾雜質(zhì)較多，影響后期凈化處理，同時甲醇與加入的水互溶，不利于分析。乙腈滲透能力強，作為提取試劑總體回收率較好，提取效果好，所以選用乙腈作為提取試劑。

2.2.2 提取溶劑體積

向三七樣品中添加20 μg/kg 濃度水平的10 種農(nóng)藥，分別加入10、15、20、25 mL 乙腈溶劑，考察目標農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果顯示，加入20 mL 乙腈時各農(nóng)藥提取效果相對較好，繼續(xù)增加體積，提取效果沒有明顯提升。所以最終確定提取溶劑乙腈的加入體積為20 mL。

2.2.3 凈化條件

首先將未凈化的提取上清溶液直接過膜進樣分析，結(jié)果顯示各目標農(nóng)藥的回收率均大于120%，可能由于三七提取液內(nèi)含成分復雜，產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)，且不凈化直接進樣易造成離子源污染。因此需選擇合適高效快捷的凈化方法對樣品提取液凈化，以降低三七中有機質(zhì)等對目標農(nóng)藥分析的影響。

選擇高效的分散固相萃取法作為樣品凈化方法，對C18、PSA、NH2、弗羅里硅土、GCB 5 種凈化材料的種類和用量加以選擇優(yōu)化。在1 mL 的上清提取液中分別加入上述凈化材料100 mg(GCB 20 mg)，結(jié)果顯示，10 種目標農(nóng)藥提取率在83%～115%之間，說明5 種凈化材料均能滿足凈化要求，但用PSA、NH2、GCB 凈化后的提取液顏色較淺，凈化效果相對更好。由于不同凈化材料對干擾物吸附性能不同，最終選擇PSA、NH2、GCB 的混合材料作為本實驗的凈化材料，并對各凈化材料的用量比例(PSA、NH2和GCB的質(zhì)量比分別為1∶3∶1、2∶2∶1、3∶1∶1)和總用量(50、100、150、200 mg)進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，對于克百威、涕滅威及代謝物當用量比例為1∶3∶1、2∶2∶1 時凈化效果較好，當用量比例為2∶2∶1、3∶1∶1 時氟蟲腈及代謝物凈化效果相對更好，但對于水胺硫磷用量比例為2∶2∶1 時凈化效果最好。綜合考慮，最終確定選擇PSA、NH2和GCB的質(zhì)量比2∶2∶1。對凈化材料總用量進行優(yōu)化，當用量大于100 mg 時，凈化效果沒有明顯增強，因此，最終選擇總用量為100 mg。

此外，試驗結(jié)果表明，用傳統(tǒng)的固相萃取方式(HLB 固相萃取柱)對樣品提取液進行凈化，回收率為88.3%～113.1%，方法同樣滿足要求，但相比之下，分散固相萃取法更加簡便快速、成本低，更適用于大批量樣品的殘留分析檢測。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象(ME)是樣品提取過程中共提取的雜質(zhì)干擾物會對目標分析物的儀器響應(yīng)產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為對分析物響應(yīng)增強或抑制。分別配制相同質(zhì)量濃度各農(nóng)藥的溶劑和基質(zhì)系列標準溶液，分別以色譜峰面積和質(zhì)量濃度繪制標準曲線，基質(zhì)效應(yīng)(ME)的強弱通過對基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線的斜率比較計算值進行評價。當|ME|＜20%時為弱基質(zhì)效應(yīng)；當20%≤|ME|＜50%時為中等強度基質(zhì)效應(yīng)；當|ME|≥50%時為強基質(zhì)效應(yīng)[15]。結(jié)果表明(見表2 )，僅有克百威、涕滅威、水胺硫磷表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)，其余農(nóng)藥均表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)。為減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，筆者采用基質(zhì)匹配的標準曲線進行各農(nóng)藥定量分析。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

配制10 種農(nóng)藥的系列混合基質(zhì)標準溶液，在1.2 儀器工作條件下，以各農(nóng)藥的色譜峰面積對其質(zhì)量濃度進行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

以3 倍信噪比添加濃度作為方法檢出限(LOD)，以10 倍信噪比的添加濃度作為方法定量限(LOQ)。

10 種農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表2。由表2 可知，10 種農(nóng)藥在0.001～0.2 μg/mL 線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.998，表明線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.3～2.8 μg/kg，該方法中10 種農(nóng)藥的檢出限較低，能夠滿足農(nóng)藥殘留的分析要求。

表2 10 種農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及基質(zhì)效應(yīng)

2.5 加標回收與精密度試驗

采用三七空白基質(zhì)，分別以約1 倍、5 倍、10 倍各農(nóng)藥的定量限進行低、中、高三個濃度水平加標回收試驗，每個添加濃度水平做6 個平行試驗，用基質(zhì)標準曲線進行定量，結(jié)果見表3?？瞻讟悠?、加標樣品色譜圖如圖1、圖2 所示。由表3 可知，10 種農(nóng)藥的平均回收率為90.4%～110.5%，相對標準偏差小于7.9%，表明建立的方法回收率和重現(xiàn)性較好，符合農(nóng)藥殘留測定的要求，適用于三七中10 種農(nóng)藥及相關(guān)代謝物殘留的同時測定。

圖1 空白三七樣品色譜圖

圖2 空白三七樣品加標色譜圖

表3 10 種農(nóng)藥的加標回收與精密度試驗結(jié)果(n=6) %

續(xù)表3

3 結(jié)語

建立了一種采用分散固相萃取凈化方式的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速測定三七中農(nóng)藥及代謝物殘留的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，提取溶液通過PSA、NH2和GCB 混合材料凈化，以基質(zhì)標準曲線定量，能快速實現(xiàn)三七中農(nóng)藥及代謝物的含量分析。該方法具有較好的準確度和精密度，滿足復雜基質(zhì)中痕量農(nóng)藥分析要求，且簡單、快速、穩(wěn)定，可用于批量三七樣品中農(nóng)藥及代謝物殘留的快速分析測定。本研究可為中藥材產(chǎn)品中農(nóng)藥及代謝物殘留分析提供實驗基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。