張曉娟，李冬云，陳立波，陳潔

[玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心化學(xué)室，玉林中藥材(含香辛料)質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣西玉林 537000]

清咽類保健食品是具有一定清咽利喉作用的特殊食品，能緩解喉部不適的癥狀，需求量日益增加。市場(chǎng)上的清咽保健食品品種繁多，但質(zhì)量良莠不齊，甚至有商家為了增加產(chǎn)品效果，違法添加藥物以期達(dá)到起效快的目的，添加的品種涵蓋止咳平喘類、抗生素類、激素類等，對(duì)消費(fèi)者健康造成嚴(yán)重危害。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)清咽類中成藥非法添加的化學(xué)成分研究較多[1-15]，但針對(duì)清咽類保健食品非法添加成分研究較少，激素類藥物具有強(qiáng)大的抗炎作用，若長(zhǎng)期服用，可能會(huì)引起庫(kù)欣綜合征，給消費(fèi)者帶來(lái)很大的安全隱患。

非法添加激素類藥物的檢測(cè)方法主要有TLC法[3]、液相色譜法[4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5]，曲安西龍、潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松、氟米龍、氟氫可的松醋酸酯、地夫可特、潑尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、地塞米松醋酸酯是在清咽類保健食品中發(fā)現(xiàn)的非法添加激素類藥物，現(xiàn)有文獻(xiàn)中尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)清咽類保健食品中該14 種激素類藥物的方法，一些文獻(xiàn)中測(cè)定的激素類化學(xué)成分不夠全面[16-23]，不法分子可能存在為逃避執(zhí)法而添加標(biāo)準(zhǔn)限制外的成分，需要盡可能全面覆蓋種類進(jìn)行篩查。因此筆者建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定清咽類保健食品中可能添加的14 種激素類藥物，以期為其安全生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)進(jìn)一步完善清咽類保健食品中非法添加多成分分析的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Xevo-TQ-Smicro 型，美國(guó)沃特世公司。

電子分析天平：S-205DU 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水儀：Milli-Q 型，美國(guó)密理博公司。

甲酸：優(yōu)級(jí)純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

清咽類保健食品樣品：含片，市售。

其它所用試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水：GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

14 種激素類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：名稱、純度及生產(chǎn)單位等見(jiàn)表1。

表1 14 種激素類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

續(xù)表1

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：Agilent SB-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5μL；流動(dòng)相：A 相為水，B 相為乙腈，流量為0.3 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

離子模式：ES+；毛細(xì)管電壓：2.50 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣：氮?dú)?，流量?0 L/h；脫溶劑氣：氮?dú)?，流量? 000 L/h；14 種激素類化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 14 種激素藥物的質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表3

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品溶液的制備

稱取樣品0.2 g，置于15 mL 具塞離心管中，加入少量50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙腈溶液，渦旋30 s 至試樣與提取溶劑混合均勻，然后加入50%的乙腈溶液至近10 mL，超聲提取20 min，靜置至室溫，用50%的乙腈溶液定容至10 mL，搖勻，以10 000 r/min 離心5 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，濾液作為樣品溶液。

1.3.2 陰性樣品溶液的制備

參考樣品說(shuō)明書提供的配方原料，取金銀花、胖大海、青果、桔梗、麥冬、甘草、羅漢果、菊花、枇杷等中藥各2～10 g，加水500 mL 煎熬30 min，制成陰性樣品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別精確稱取14 種激素類化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品各10.00 mg(精確至0.01 mg)，置于不同的20 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，混勻，得質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取14 種單一標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，制得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，其中各組分質(zhì)量濃度均為5 μg/mL。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取6 只10 mL 容量瓶，依次精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10、20、40、60、80、100 μL，用甲醇稀釋并定容，搖勻，制得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中14 種組分的質(zhì)量濃度均分別為5、10、20、30、40、50 ng/mL。

1.3.4 定量方法

按1.2 儀器工作條件測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性方程，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法優(yōu)化

清咽類保健食品樣品均是含糖量較高的含片，需要用水溶解才能易于測(cè)定，14 種糖皮質(zhì)激素的極性較小，在弱極性或中等級(jí)性有機(jī)溶劑中有較高的溶解性，參考文獻(xiàn)[13]，分別選擇甲醇、乙腈及體積分?jǐn)?shù)均為50%的甲醇溶液、乙腈溶液及體積分?jǐn)?shù)均為75%的甲醇溶液、乙腈溶液6 種溶劑作為提取溶劑，超聲提取時(shí)間分別設(shè)置為10、20、30 min，進(jìn)行樣品提取試驗(yàn)。結(jié)果顯示，6 種提取溶劑中，乙腈提取效果好于甲醇，而體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液稍高于其它；超聲提取時(shí)間在20 min 的提取率比10 min高，與30 min 無(wú)明顯區(qū)別。綜合考慮提取時(shí)間和提取率，選擇使用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液作為提取溶劑，超聲時(shí)間為20 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

14 種激素具有相似的母核結(jié)構(gòu)，極性較弱且難以分離。實(shí)驗(yàn)考察了Agilent SB-C18、Waters ACQUITY UPLC BEH 及CAPCELL CORE C18這3種型號(hào)的色譜柱，對(duì)14 種化合物進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用CAPCELL CORE C18柱色譜峰峰形較理想，但分離度不高，不如Agilent SB-C18柱的分離效果；使用Waters ACQUITY UPLC BEH 柱各成分基本實(shí)現(xiàn)分離，但色譜峰形不理想；使用Agilent SB-C18柱色譜峰形較好，響應(yīng)值高。故選擇Agilent SB-C18色譜柱進(jìn)行分離。

實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水和甲醇-水的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有乙腈的流動(dòng)相比含有甲醇的流動(dòng)相保留時(shí)間縮短，多數(shù)成分色譜峰形較好，響應(yīng)值也較高。通過(guò)梯度洗脫可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物有效分離。因此最終采用乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源的正離子模式和負(fù)離子模式下，分別對(duì)質(zhì)量濃度為5 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，獲得準(zhǔn)分子離子或加合離子。掃描結(jié)果表明：在負(fù)離子模式下大部分目標(biāo)物質(zhì)離子的相對(duì)豐度多數(shù)不到正離子模式下的1/2，因此實(shí)驗(yàn)在正離子模式下進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜條件，通過(guò)改變碰撞能量和錐孔電壓，選擇信號(hào)較強(qiáng)、干擾較小的子離子對(duì)，其中豐度相對(duì)較大的為定量離子，另一個(gè)為定性離子，在MRM 模式下對(duì)2 個(gè)碎片離子進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。14 種激素類藥物的總離子流圖見(jiàn)圖1，監(jiān)測(cè)離子色譜圖見(jiàn)圖2～圖15。

圖1 14 種激素類藥物的總離子流色譜圖

圖2 曲安西龍的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖3 潑尼松龍的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖4 潑尼松的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖5 氫化可的松的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖6 可的松的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖7 甲基潑尼松龍的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖8 倍他米松的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖9 地塞米松的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖10 氟米龍的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖11 氟氫可的松醋酸酯的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖12 地夫可特的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖13 潑尼松醋酸酯的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖14 可的松醋酸酯的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

圖15 地塞米松醋酸酯的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

2.4 線性關(guān)系與檢出限

在1.2 儀器工作條件下，分別測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以溶液的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)、色譜峰面積y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。分別以定量離子的3 倍、10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的樣品中目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為方法檢出限和定量限。

14 種激素類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限列于表4。結(jié)果表明各組分質(zhì)量濃度在5～50 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990，檢出限為0.002～0.211 μg/g，定量限為0.007～0.704 μg/g。

表4 14 種激素類藥物的線性范圍、線性方程、檢出限與定量限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

稱取陰性樣品9 份，分別添加3 種不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，高、中、低濃度添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液體積分別為20、40、60 μL，在1.2 儀器工作條件下分別測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表5。由表5 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%～2.3%，平均加標(biāo)回收率為92.1%～104.0%，表明該方法在不同添加水平均有較好的回收率和重復(fù)性，方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 結(jié)語(yǔ)

建立了液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)清咽類保健食品中14 種激素類藥物同時(shí)定量、定性測(cè)定，該方法能在20 min 內(nèi)對(duì)14 種成分進(jìn)行快速篩查，在實(shí)際應(yīng)用中可進(jìn)行清咽類保健食品中是否非法添加14 種激素類化學(xué)藥物進(jìn)行快速篩查。該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，能短時(shí)間同時(shí)測(cè)定多種激素類藥物，滿足目標(biāo)分析物的定性和定量要求，為開展清咽類保健食品非法添加的檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，加強(qiáng)食品安全質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支持。