江 蕾，黎純敏，曾育麟

(西昌市動物疫病預防控制中心，四川 西昌 615000)

0 引言

隨著社會發(fā)展，動物交易方式方法越來越多，動物疫病隨著動物交易與運輸，流傳速度越來越快，流傳范圍也越來越廣，表現(xiàn)癥狀也越來越復雜。動物疫病的診斷與防控已無法完全依靠肉眼判斷的結(jié)果進行，需要獸醫(yī)實驗室進行相應的動物疫病試驗支持?；鶎荧F醫(yī)人員在接到動物疫病發(fā)生報告或排查過程中發(fā)現(xiàn)動物疫病時，須第一時間到達動物疫病發(fā)生現(xiàn)場進行流行病學調(diào)查，并根據(jù)不同的動物疫病檢測要求采集不同的樣品送獸醫(yī)實驗室進行相應檢測試驗。所以，基層獸醫(yī)人員對動物疫病樣品的采集質(zhì)量是動物疫病的診斷與防控的基石。本文主要針對動物的血樣、組織樣品及拭子等動物疫病常見樣品的采樣原則、操作方法及注意事項進行探討。

1 采樣的一般原則

1.1 活畜禽

1)血液樣品:在采樣前一般禁食8 h，然后根據(jù)采樣對象、檢驗目的及所需的血量確定采血的方法與采血部位。禁止采集血腫部位血液。

2)體表樣品:采集病變部位與健康部位的交界處、病變部位。

3)拭子:拭子須在指定部位充分旋轉(zhuǎn)。

4)血紙:血液量須浸透采集紙片。

5)糞便：必須是新鮮糞便。

1.2 動物尸體

1)血液。凡是血液凝固不良、天然孔出血的病死動物，首先排除炭疽，然后采集耳尖血。

2)組織樣品。①應從胸腔到腹腔，先采實質(zhì)臟器，最后采腔腸器官等部位，盡量無菌采集，避免外源性污染。②采取的病料必須有代表性，采取的臟器組織應為病變明顯部位和健康部位交界處、病變部位，根據(jù)不同的疫病或檢驗目的采取相應的組織樣品。③死亡時間不超過6 h。

1.3 環(huán)境拭子

選取有代表性的環(huán)境進行采樣。

1.4 生物安全

1)個人安全。在進入每個采樣場地前需要做好個人防護，有條件的使用一次性防護用品，無條件的須在進入下一個場地前對全部個人防護用品使用消毒藥或是酒精消毒。

2)動物安全。在采集每一份樣品時，都必須使用一次性采樣器械，禁止混用。

3)環(huán)境安全。①解剖動物尸體時，須防止血水等對環(huán)境的污染。②采樣過程中和采樣結(jié)束后產(chǎn)生的各種垃圾，禁止隨意丟棄，須考慮環(huán)境影響等，做好無害化處理。

1.5 采樣順序

首先采集活畜禽樣品，然后再采集動物尸體。

2 采樣前的準備

按照參與人員與樣品采集數(shù)量進行匹配準備。

2.1 器具的準備

1)采樣器具:采樣箱、解剖器械、普通真空采血管(針)、抗凝血真空采血管(針)、注射器、酒精棉球、干棉球、采樣刀剪、推毛剪、5 mL離心管、醫(yī)用棉簽(棉花頭無飛絮)、采血濾紙等。

2)輔助器材:冷藏箱、冰袋、雙頭油性記號筆(一頭筆尖為0.5 mm)、簽字筆、試管架、密封袋、采樣登記表、PBS液(病毒保存液)、利器盒、無害化處理袋等。

2.2 防護用品的準備

一次性防護服、一次性乳膠手套、口罩、防護帽、鞋套、護目鏡、面罩、肥皂、免洗酒精等。

2.3 人員準備

至少需要3人，保定人員1人以上，采樣人員1人，采樣助手1人以上。保定人員負責保定，采樣人員負責采樣，采樣助手負責登記、編號、輔助采樣等。

3 采樣方法

采樣方法有采血、采拭子(環(huán)境拭子、咽泄鼻眼拭子)、采組織樣等。

3.1 采血方法

采血主要針對豬、牛、羊和禽，不同的動物采血部位與采樣器械均不同。

1)真空采血針采血。該采血法適用豬、牛、羊、禽身體表面靜脈血管采血。具體步驟：用酒精棉球?qū)⒉裳课幌?酒精棉球同時可以起到刺激血管作用讓血管凸起方便采血)，待酒精干后，采血針要順著血管水平方向進針，針尖斜進口向上并與皮膚呈30°～45°，針尖刺入血管后立即改變傾斜度，需要順著血管水平方向前進1/3～2/3針頭，并固定針頭，讓其斜進口面對采血人。采血針刺入后血管后，采血針與軟管交界處出現(xiàn)血液說明針尖進入血管，可以繼續(xù)采血，否則需要重新更換未使用過的采血針換個采血部位再按以上步驟進行?？梢圆裳?，將出血針頭插入采血管中，讓血液順著管壁流下，不要讓血液對著管底猛沖，待血量達到要求后(3～5 mL)，用干棉球按壓針眼，拔出采血針頭，輕壓止血。在采血管上1/3處用油性記號筆做好唯一性標記。

2)采血盛血器采血。該采血法適用豬、牛、羊、禽身體表面靜脈血管、豬前腔靜脈采血。①身體表面靜脈血管采血。用酒精棉球?qū)⒉裳课幌荆凭珊?，針頭要順著血管水平向進針，針尖斜進口向上并與皮膚呈30°～45°，針尖刺入血管后立即改變傾斜度，需順著血管水平方向前進1/3～2/3針頭，并固定針頭，讓其斜進口面對采血人。針頭刺入血管后，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，針頭與針身交界處出現(xiàn)血液說明針尖進入血管，可以繼續(xù)采血，否則需要重新更換未使用過的采血盛血器換個采血部位再按以上步驟進行?？梢圆裳?，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，讓血液緩慢順著管壁流下，待血量達到要求后(3～5 mL)，用干棉球按壓針眼，拔出針頭，輕壓止血。在采血盛血器靠近針頭的前1/3處用油性記號筆做好唯一性標記。②豬前腔靜脈采血。用酒精棉球?qū)⒉裳课幌?，待酒精干后進行采血。針筒一般為5 mL或10 mL的一次性針筒。由于豬的大小不同，前腔靜脈的深淺不一樣，要求使用的針頭是不一樣的。針頭太短刺不到前腔靜脈，針頭太長，則可能刺穿前腔靜脈，同樣采不到血。成年公母豬宜選用16號(45或50 mm)針頭，30 kg以上的成年豬和育成豬選用12號(38 mm)針頭，10～30 kg的仔豬選用9號(25 mm)針頭，10 kg以下仔豬選擇9號(20 mm)針頭。15 kg的豬可以仰臥保定，在左側(cè)前腔最凹陷處處垂直進針，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，針頭與針身交界處出現(xiàn)血液說明針尖進入血管，可以繼續(xù)采血，否則需重新更換未使用過的采血盛血器并換只豬再按以上步驟進行。可以采血后，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，讓血液緩慢順著管壁流下，待血量達到要求后(3～5 mL)，用干棉球按壓針眼，拔出針頭，輕壓止血。在采血盛血器靠近針頭的前1/3處用油性記號筆做好唯一性標記。

3.2 采血部位與保定方法

1)豬的采血與保定方法。①耳靜脈。適用于耳靜脈明顯且較粗的豬，多為經(jīng)產(chǎn)母豬、公豬、肥豬。保定人員將豬站立或臥倒保定好，特別是將豬耳朵固定好讓其不能晃動或搖動，采樣助手用手按壓住耳根處，讓耳朵上的靜脈血管充分暴露。采樣人員左手牽拉豬耳，讓其完全展開，然后采用真空采血針采血方法進行采血。先從耳靜脈遠心端向近心端進針，一處無法采出血液，將采血處向比前一次采血處靠近心端的血管處移動或是換只耳朵，禁止采集血腫處的血液。②前腔靜脈。主要適用于15 kg以下的仔豬，保定人員將其仰臥解剖位或是直立保定，采樣人員采用豬前腔靜脈采血方法進行采血。

2)牛的采血與保定。①頸靜脈。適用于有保定架或是類似的保定裝置的地方，保定裝置不能被牛隨意移動或折斷。保定人員將牛頭頸部保定好，使牛頭向牛身右側(cè)偏仰，采樣人員用左手大拇指和其余四指卡住牛頸靜脈近心端，讓頸靜脈充分暴露出來，然后采用真空采血針采血方法順著頸靜脈遠心端進行采血。右側(cè)頸靜脈無法采血或是采血到一半時牛掙脫開采血針，需要換左側(cè)頸靜脈采血。②尾靜脈。適用于有柱子或是類似裝置的地方。將牛栓在柱子上，將其尾根部提起，在離尾根10 cm左右，第4、5尾椎骨交界中點凹陷處用酒精消毒后垂直進針。一般采用真空采血針采血方法進行采血。采血到一半時牛掙脫開采血針，應換一頭牛進行采血。

3)羊的采血與保定。羊采用頸靜脈采血操作。保定人員將羊站立保定好，羊頭向羊身左側(cè)偏仰，毛長的羊要用推毛剪將采血部位頸靜脈處毛除去。采樣人員用左手大拇指和其余四指卡住羊頸靜脈近心端，讓頸靜脈充分暴露出來，然后采用真空采血針采血方法順著頸靜脈遠心端進行采血。右側(cè)頸靜脈無法采血或是采血到一半時羊掙脫開采血針，應換左側(cè)頸靜脈采血或是換一頭羊進行采血。左側(cè)頸靜脈采血，羊頭向羊身右側(cè)偏仰。

4)禽的采血與保定。①翅靜脈。保定人員將禽保定，右側(cè)向上，采樣人員或采樣助手牽拉右翅，將右翅暴露出來，扯掉右中翅處羽毛，暴露靜脈血管。采樣人員采用采血盛血器采血方法進行采血。如果左中翅沒有采血成功，換同一只雞的右中翅或換只雞進行采血。禁止采集血腫處血液。②趾靜脈。保定人員將禽保定，左側(cè)向上，將右腳暴露出來。從右腳第一趾和第二趾處尋找比較粗的趾靜脈。采樣人員采用采血盛血器采血方法進行采血。

3.3 采集拭子樣品

1)環(huán)境拭子。在養(yǎng)殖場、辦公區(qū)、生活區(qū)的不同地方(具有代表性和容易藏污納垢的地方)，比如圈舍過道、飼槽、圈舍壁、排糞污口(溝)、飼料推車、辦公室、生活間等地方進行采樣，采樣人員用棉簽在這些地方反復擦拭數(shù)次后保存在裝有PBS液的5 mL離心管內(nèi)，并做好采樣登記與唯一性標識。棉簽在裝入離心管時，需在管口將棉棒去掉，只保留棉頭進入離心管。一個離心管裝多個棉頭時，棉頭與棉頭、棉頭與離心管之間需保留一定縫隙，以便棉頭充分吸取PBS液。樣品唯一性標識用油性記號筆標記在離心管管蓋上。

2)咽泄、眼、鼻拭子。將干棉簽伸入咽喉部、泄殖腔1.5～2 cm處或眼鼻處輕輕擦拭幾次后保存于裝有PBS液的5 mL離心管內(nèi)，并做好采樣登記與唯一性標識。棉簽在裝入離心管時，需要在管口將棉棒去掉，只保留棉頭進入離心管。一個離心管裝多個棉頭時，棉頭與棉頭、棉頭與離心管之間需保留一定縫隙，以便棉頭充分吸取PBS液。樣品唯一性標識用油性記號筆標記在離心管管蓋上。

3.4 采集血紙

主要針對不方便固定保定采血的牛。保定人員將牛頭牽住，使用無菌針頭戳穿牛耳朵上的靜脈血管，用采血紙吸取血液浸透至少0.5 cm×0.5 cm大小。在血紙上做好唯一性標識與采樣登記。待血紙陰涼晾干后再與其他采集好的血紙集中存放。

3.5 采集糞便

采集24 h內(nèi)離采集時間最近的糞便，做好采樣登記與唯一性標識。

1)從地上采集牛、馬糞便需要采集糞便中間，每份糞便為成年男人拳頭大小。

2)從地上采集羊、禽等糞便需要采集最新鮮的糞便，能區(qū)分單樣的保存為單樣，不能區(qū)分的保存為混合樣品。

3)羊糞便樣品需要和羊只一一對應時，應采集直腸糞便，助手將羊站立保定，采樣人員左手抬起羊尾，右手戴上指套的食指直接從羊肛門處摳取羊糞，每份樣品至少20粒羊糞。

3.6 采集組織樣品

采集組織樣品主要針對病死動物。應根據(jù)臨床癥狀或剖解的初步診斷，有選擇地采取組織樣品，難以判定疑似病種的要全面采集病料。采取的病料必須有代表性，采取的臟器組織應為病變明顯部位和健康部位交界處、病變部位，大小為1 cm×1 cm。應從胸腔到腹腔，先采實質(zhì)臟器，最后采腔腸器官等部位，盡量無菌采集，避免外源性污染。

根據(jù)不同的疫病或檢驗目的采取相應的組織樣品。病料采集后直接保存于滅菌后的采集管內(nèi)，并做好采樣登記與唯一性標識。

4 注意事項

1)做好生物安全防護，個人、動物、環(huán)境安全缺一不可。采樣過程中產(chǎn)生的廢棄物須有防泄漏容器收集后做無害化處理。

2)不建議使用大號注射針頭加真空采血管的方法進行采樣。原因一是無法控制血流采集速度，血液凝集后易形成果凍樣，無法分離得到試驗用血清；二是對被采血動物造成的創(chuàng)口可能被自體血壓擴大，不利于被采血動物恢復。

3)不建議使用注射器采血與保存血液。原因一是使用注射器采血并保存血液后，無法分離得到試驗用血清；二是使用注射器采血后，使用注射器將血液注射保存于其他容器內(nèi)，血液凝集后易形成果凍樣，無法分離得到試驗用血清。

4)采血盛血器不是注射器，是專用的采血工具。

5)禽采血一般采用采血盛血器采血方法。不建議使用真空采血針采血方法，原因一是使用真空采血針采血后，采血真空壓力瞬間過大，采血針頭極容易被壓在靜脈壁上，不利于血液采集；二是使用真空采血針采集的禽血，血液凝集后易形成果凍樣，無法分離得到試驗用血清。

6)在采血過程中一定要讓血液順著管壁緩慢流下，不要讓血液對著管壁或管底猛沖，因為這樣會破壞血細胞造成溶血影響實驗結(jié)果。

7)抗凝血劑應按照疫病檢測種類進行選擇，如檢測非洲豬瘟的抗凝血劑需用乙二胺四乙酸二鈉。

8)采集抗凝血時一定要注意，采好血樣時要將管子上下輕輕顛倒幾次讓血液和管子里的抗凝劑充分混合，以防止血液凝集。

9)在采集環(huán)境拭子時，可沾取無菌生理鹽水或PBS液擦拭環(huán)境。

10)采樣過程中一定要做好采樣表登記和樣品唯一性編號，且登記編號和樣品編號相符，以便回溯檢測結(jié)果。

11)樣品的唯一性編號須跟隨樣品，不易丟失、模糊、擦除，建議使用油性記號筆在樣品上或樣品保存容器表面醒目處進行標記。

12)采好的樣品須防泄漏并冷藏運輸。非抗凝樣品在運輸過程中盡量避免晃動。

13)如果樣品在24 h內(nèi)無法送達實驗室：48 h內(nèi)能送達的樣品保存在8℃以下的冷藏室中；2～7 d才能送達，血液樣品須分離提取血清，與組織樣品等保存在低于-20℃下的冰柜中；7 d以上才能送達，血液樣品須分離提取血清，與組織樣品等保存在低于-70℃下的冰柜中。

5 結(jié)語

動物疫病的確診需要實驗室的檢測結(jié)果支持，樣品的真實性和準確性極大的影響試驗結(jié)果的準確性。只有采樣人員具備專業(yè)的采樣技術和能力，才能夠按不同的疫病要求采集不同的合格樣品，為動物疫病的防控提供有效的技術支撐。