孟岳成，黃阮卿，陳杰，李延華，汪振濤，仝靜雯

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

酸馬奶（Koumiss）主要是由乳酸菌、乳糖發(fā)酵酵母、非乳糖發(fā)酵酵母三大類(lèi)微生物協(xié)同發(fā)酵新鮮馬乳而來(lái)，其風(fēng)味獨(dú)特，常食用酸馬奶可以降血脂，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善肺結(jié)核、貧血、中風(fēng)等疾病[1-3]。酸馬奶的生產(chǎn)加工方式較傳統(tǒng)，冷藏過(guò)程中后酸化和后苦味現(xiàn)象嚴(yán)重，貨架期明顯短于普通酸奶，運(yùn)輸與銷(xiāo)售成本較高，難以推廣。

熱處理通常用于控制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖以延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。然而，研究表明，在加熱過(guò)程中，對(duì)熱敏感的乳清蛋白含量明顯降低，這些蛋白會(huì)與酪蛋白或者乳脂小球變性并聚集在一起[4-5]。溫度高且時(shí)間長(zhǎng)的熱處理會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品褐變、蛋白質(zhì)大量沉淀等不穩(wěn)定現(xiàn)象的發(fā)生，不同來(lái)源的乳因主要營(yíng)養(yǎng)成分含量及比例的不同而對(duì)熱敏感性有所差異。目前，對(duì)乳制品中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究較多，如Kelleher 等[6]研究發(fā)現(xiàn)高于70 ℃的熱處理會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性官能團(tuán)暴露，易與酪蛋白膠束表面的其它蛋白反應(yīng)，形成乳清蛋白聚集體等復(fù)合物。而在乳制品中加入酪蛋白，可以形成酪蛋白-乳清蛋白聚集體，從而提高乳制品的熱穩(wěn)定性。Luo 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白和乳清蛋白的穩(wěn)定性幾乎決定驢乳的熱穩(wěn)定性。驢乳中酪蛋白膠束較乳清蛋白對(duì)熱敏感。Zhao 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，山羊奶的熱處理溫度高于85 ℃時(shí)，乳清蛋白易發(fā)生形態(tài)損傷且規(guī)則結(jié)構(gòu)數(shù)量隨熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，大量乳清蛋白變性。然而，熱處理對(duì)常溫酸乳制品中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響研究報(bào)道較少，且關(guān)于酸馬奶還未見(jiàn)報(bào)道。

馬乳中含有的化學(xué)成分及生物活性物質(zhì)與母乳極其相似，且其高濃度的乳清蛋白含量使馬乳比牛乳更適宜作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[9]。傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶在熱處理過(guò)程中體系的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，影響其聚集方式和程度，進(jìn)而影響體系的穩(wěn)定性。本研究選擇低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌和酸乳熱處理的方式對(duì)酸馬奶進(jìn)行熱加工，測(cè)定其相關(guān)指標(biāo)，并分析其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，旨在揭示熱處理所致酸馬奶蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 酸馬奶，內(nèi)蒙古中蘊(yùn)馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司；十二烷基硫酸鈉、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、丙烯酰胺（30%），美國(guó)BIO-RAD 公司；Tris、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)，美國(guó)Amresco 公司。以上試劑均為分析純級(jí)。牛血清白蛋白，瑞士Roche 公司；雙色預(yù)染蛋白Marker，上海生工生物工程股份有限公司；溴化鉀（光譜級(jí)），上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 DELTA-320 精密pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；NANO ZS90 馬爾文納米粒度電位儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；UV-2600 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；3K30 低溫高速離心機(jī)，德國(guó)SIGMA 公司；變性梯度凝膠電泳儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；GelDoc 2000 凝膠成像儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；K775X 高真空冷凍干燥儀，英國(guó)Quorum 公司；Nicolet 6700 傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸馬奶的熱處理 以30 ℃、200 bar 均質(zhì)的酸馬奶為研究對(duì)象，熱處理?xiàng)l件：65 ℃/30 min低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌，75 ℃/15 min，83 ℃/10 min 和90 ℃/5 min 酸乳熱處理。參考Li 等[10]的方法并稍作修改，具體操作：將酸馬奶分裝于試管（Ф10×150 mm）中，試管口用封口膜密封，將試管浸于沸水浴中至樣品中心溫度達(dá)到所需溫度，迅速取出，置于該溫度的水浴中，分別保持30，15，10，5 min后冰水浴快速冷卻至4 ℃，以未作熱處理的酸馬奶為對(duì)照組。

1.2.2 懸浮、沉淀及乳清樣品制備 參考Xiong 等[11]的方法并稍作修改，具體操作：熱處理前、后酸馬奶樣品經(jīng)4 ℃、10 000×g 高速離心30 min，棄脂肪層，分別收集懸浮上清液和沉淀物質(zhì)，將沉淀物在與原取樣液等量的超純水中重新分散均勻，備用。取適量懸浮上清液，用1.0 mol/L 碳酸鈉溶液調(diào)整其pH 值至4.6，沉淀酪蛋白及所有變性的乳清蛋白，4 000 r/min 離心15 min 除去沉淀，經(jīng)0.45 μm水系微孔濾膜過(guò)濾，得到乳清樣品。

1.2.3 酸馬奶酸度的測(cè)定 酸馬奶酸度采用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定測(cè)得，以吉爾涅爾度表示[12]。

1.2.4 酸馬奶pH 值的測(cè)定 pH 值使用精密pH計(jì)測(cè)定。

1.2.5 酸馬奶黏度的測(cè)定 采用NDJ-5S 數(shù)顯黏度計(jì)測(cè)定，選擇1 號(hào)轉(zhuǎn)子，60 r/min 轉(zhuǎn)速保持30 s，待數(shù)值穩(wěn)定后讀取。

1.2.6 酸馬奶ζ-電位的測(cè)定 ζ-電位按照Z(yǔ)iaefar 等[13]的方法測(cè)定。

1.2.7 離心上清液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定[14]。

1.2.8 SDS-PAGE 參考Pan 等[15]的方法并稍作修改進(jìn)行SDS-PAGE。選用5%的濃縮膠和12%的分離膠，采用5×Tris-甘氨酸電泳緩沖系統(tǒng)。凝膠電泳初始電壓設(shè)定為70 V，經(jīng)30 min 或染色條帶剛經(jīng)過(guò)濃縮膠與分離膠的分界線時(shí)，調(diào)整電壓為110 V，樣品電泳至膠底部時(shí)結(jié)束。考馬斯亮藍(lán)R-250 搖床染色2～3 h，然后，用醋酸-乙醇溶液（V無(wú)水乙醇∶V乙酸∶V水=25∶8∶67）搖床脫色過(guò)夜至背景清晰后置凝膠成像系統(tǒng)中掃描拍攝。

1.2.9 乳清蛋白變性率的測(cè)定 根據(jù)乳清蛋白氮指數(shù)（WPNI）的方法原理測(cè)定[16]。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定乳清樣品中未變性乳清蛋白含量，即WPNI，計(jì)算方法見(jiàn)公式（1）。

式中：W1——原酸馬奶的WPNI/（mg/mL）；W2——熱處理酸馬奶的WPNI/（mg/mL）。

1.2.10 紅外光譜分析 將酸馬奶離心脫脂后冷凍干燥呈細(xì)粉末狀，取粉末（約1 mg）與干燥的色譜級(jí)溴化鉀（約200 mg）在瑪瑙研缽中充分研碎、研勻，壓制成均勻透明或半透明薄片。傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定前，先扣除背景吸收，設(shè)定條件：掃描波段4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描32次。使用PeakFit Version 4.0 軟件對(duì)特征譜帶進(jìn)行基線校正、斯托克斯平滑和去卷積處理，二階導(dǎo)數(shù)高斯（Gaussian）擬合后分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。采用Origin 9.0 軟件作圖，采用SSPS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析（Duncan 新復(fù)極差檢驗(yàn)法，顯著水平P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)酸馬奶酸度、pH 值、黏度和ζ-電位的影響

表1 列出不同熱處理的酸馬奶酸度、黏度和ζ-電位的變化情況。熱處理后酸馬奶的吉爾涅爾度和pH 值無(wú)顯著變化（P＞0.05），而黏度和ζ-電位變化顯著（P＜0.05）。隨著熱處理溫度的升高，黏度呈上升趨勢(shì)，這可能與酸馬奶蛋白間交聯(lián)度增強(qiáng)有關(guān)；加熱引起酸馬奶乳清蛋白變性，其與酪蛋白膠束締合，影響膠束間的相互作用，隨著變性程度增加，黏度增加[18]。隨著熱處理溫度的增強(qiáng)，ζ-電位呈先增大后減小的趨勢(shì)，其中83 ℃/10 min 時(shí)的ζ-電位達(dá)到最大值27.1 mV，而90 ℃/5 min 時(shí)顯著降至25.9 mV，這可能是因?yàn)樗嵝詶l件下，適當(dāng)熱處理，κ-酪蛋白與乳清蛋白結(jié)合成穩(wěn)定的可溶性β-乳球蛋白-κ-酪蛋白復(fù)合物，導(dǎo)致膠體表面電勢(shì)增加[19]；而表面電勢(shì)降低推測(cè)為，溫度較高的熱處理引起κ-CN 解離，酪蛋白膠束形成不規(guī)則復(fù)合體，這可能也與酸馬奶中酪蛋白具有特殊的海綿狀結(jié)構(gòu)，且蛋白質(zhì)含量低于牛奶、羊奶、駱駝奶等有關(guān)[20-21]。

根據(jù)Stokes 定律，懸浮體系中顆粒的沉降速率與黏度呈反比，同時(shí)，ζ-電位可以衡量蛋白膠束間靜電作用的強(qiáng)弱，其絕對(duì)值越高，越有利于體系穩(wěn)定[22]。由表1 可知，在65～83 ℃對(duì)酸馬奶進(jìn)行適當(dāng)時(shí)長(zhǎng)的熱處理，能提高其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而在90 ℃熱處理會(huì)減弱其穩(wěn)定性。

表1 不同熱處理對(duì)酸馬奶酸度、pH 值、黏度和ζ-電位的影響Table 1 Effect of different thermal treatments on acidity，viscosity and ζ-potential of koumiss

2.2 熱處理對(duì)酸馬奶蛋白質(zhì)懸浮穩(wěn)定性的影響

乳蛋白的懸浮穩(wěn)定性可用高速離心上清液蛋白質(zhì)含量和組成變化來(lái)表示，見(jiàn)圖1 和圖2。由圖1 可知，熱處理后的酸馬奶相比未處理的酸馬奶離心上清液蛋白質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05）。熱處理后蛋白懸浮性增強(qiáng)的原因可能是該條件下蛋白質(zhì)凝聚顆粒不大，而適當(dāng)變性的乳清蛋白與酪蛋白交聯(lián)提高了體系的黏度，同時(shí)在疏水基團(tuán)沒(méi)有完全暴露的情況下，靜電斥力仍大于凝聚力，起到懸浮穩(wěn)定的作用。結(jié)果表明適當(dāng)?shù)臒崽幚砟芴岣咚狁R奶蛋白質(zhì)的懸浮穩(wěn)定性。

由圖2 可知，經(jīng)不同的熱處理后，酸馬奶中蛋白質(zhì)整體條帶數(shù)量及α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）條帶顏色未發(fā)生明顯變化，其余組分條帶顏色變化明顯，主要表現(xiàn)在沉淀蛋白質(zhì)中的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）條帶顏色有所加深，懸浮上清液中的所有酪蛋白條帶顏色深淺變化更加明顯；沉淀部分酪蛋白條帶顏色隨熱處理溫度的增強(qiáng)而變淺，懸浮液中乳清蛋白條帶未發(fā)生明顯變化。表明在酸馬奶本身特定的環(huán)境中，經(jīng)熱處理，酪蛋白膠束顆粒的懸浮穩(wěn)定性提高，而β-LG 聚集程度增加并形成沉淀。結(jié)合圖1，進(jìn)一步說(shuō)明其酪蛋白懸浮增量大于乳清蛋白沉淀量。這與Fang 等[23]的研究結(jié)果相似，即熱處理后β-LG 的變化最為明顯，較其它蛋白對(duì)熱更加敏感。熱處理過(guò)程中一部分β-LG 與酪蛋白交聯(lián)，促進(jìn)了酪蛋白的懸浮穩(wěn)定性；另一部分通過(guò)二硫鍵和疏水相互作用不斷聚集成大顆粒，導(dǎo)致沉淀增加[24]。

圖1 熱處理對(duì)酸馬奶離心上清液蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of thermal treatment on protein content of centrifugal supernatant

圖2 不同熱處理酸馬奶的離心沉淀和上清液蛋白質(zhì)組成Fig.2 The koumiss protein composition in centrifugal precipitation and supernatant under different thermal treatment conditions

2.3 熱處理對(duì)酸馬奶乳清蛋白變性的影響

熱處理對(duì)酸馬奶乳清蛋白組成及變性率的影響分別見(jiàn)圖3 和圖4。由圖3 可知，熱處理后，酸馬奶乳清蛋白組分中的乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）條帶基本消失，表明乳鐵蛋白對(duì)熱十分敏感。通過(guò)光密度分析，α-LA 無(wú)明顯變化，β-LG 條帶顏色與面積隨熱處理溫度的增強(qiáng)逐漸降低，90 ℃/5 min處理后β-LG 基本消失。結(jié)果表明酸馬奶的α-LA具有較好的熱穩(wěn)定性，能耐受90 ℃的高溫，這可能與酸馬奶本身特殊的環(huán)境有關(guān)，其較低的pH值和較高的乳清蛋白與酪蛋白比例提高了α-LA的熱穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白在酸性環(huán)境中的熱穩(wěn)定性較好[25]。而β-LG 對(duì)熱敏感，在90 ℃時(shí)基本變性，此時(shí)更趨向于自身聚集沉淀。由圖4 可知，4 種熱處理方式對(duì)酸馬奶中乳清蛋白的影響存在顯著性差異（P＜0.05），隨著熱處理溫度的增強(qiáng)，變性率分別為38.52%，40.88%，50.94%，69.03%，呈加速增大的趨勢(shì)，90 ℃/5 min 的熱處理嚴(yán)重破壞了乳清蛋白的穩(wěn)定性。

圖3 不同熱處理酸馬奶的乳清蛋白組成Fig.3 The whey protein composition of koumiss under different thermal treatment conditions

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下酸馬奶乳清蛋白的變性率Fig.4 The denaturation rate of koumiss whey protein under various thermal treatment conditions

2.4 熱處理對(duì)酸馬奶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖5 所示不同熱處理后酸馬奶蛋白質(zhì)的紅外譜圖。蛋白質(zhì)的特征吸收峰出現(xiàn)在3 400 cm-1和1 650 cm-1附近，分別表示O-H、N-H 的伸縮振動(dòng)和C=O 的伸縮振動(dòng)，這與Markoska[26]、Guo 等[27]的研究結(jié)果基本相同。不同熱處理的酸馬奶蛋白質(zhì)紅外譜圖總體無(wú)較大差異，然而，3 400 cm-1附近的特征吸收峰出現(xiàn)不同方向的位移，說(shuō)明酸馬奶蛋白質(zhì)熱處理后分子內(nèi)和分子間氫鍵在發(fā)生變化，這可能是其二級(jí)結(jié)構(gòu)之間相互轉(zhuǎn)化與結(jié)合水的變化所致[28]。1 700～1 600 cm-1范圍的特征吸收峰隨熱處理強(qiáng)度的提高向低波數(shù)方向移動(dòng)，具體表現(xiàn)為65 ℃/30 min 處理后紅移1.85 cm-1，75 ℃/15 min 和83 ℃/10 min 分別比前一次熱處理再紅移0.31 cm-1和1.14 cm-1；90 ℃/5 min 熱處理酸馬奶蛋白特征峰從1 657.11 cm-1紅移至1 654.80 cm-1，較83 ℃/10 min 藍(lán)移約0.7 cm-1?？梢酝茰y(cè)，波數(shù)的移動(dòng)主要由乳清蛋白變性引起，熱處理使具有明確二級(jí)結(jié)構(gòu)的不耐熱乳清蛋白變性，主要表現(xiàn)在有序二級(jí)結(jié)構(gòu)（主要結(jié)構(gòu)為β-LG）減少，由此導(dǎo)致羰基電子云密度下降，吸收峰紅移[29]。更高強(qiáng)度的熱處理使乳清蛋白大量變性，β-LG 熱聚集達(dá)一定程度時(shí)，分子間氫鍵減弱，吸收峰藍(lán)移。

圖5 不同熱處理酸馬奶蛋白的FT-IR 譜圖Fig.5 FT-IR spectra of the koumiss protein in different thermal treatment degree

由表2 可知，未熱處理酸馬奶蛋白質(zhì)4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分別占31.90%，34.59%，18.64%，14.87%，α-螺旋和β-折疊含量接近1∶1，無(wú)規(guī)卷曲含量最低。熱處理后各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量與對(duì)照組均產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.05），α-螺旋含量隨熱處理程度的提高從31.92%降至17.01%；β-折疊顯著增加，最高含量達(dá)45.02%。分析其原因，乳清蛋白內(nèi)部折疊區(qū)域常存在較多的β-折疊結(jié)構(gòu)，熱處理引起乳清蛋白變性，α-螺旋不斷展開(kāi)，內(nèi)部區(qū)域暴露[30]；其次，變性乳清蛋白與酪蛋白膠束表面的κ-CN 通過(guò)二硫鍵結(jié)合，可能形成不同的β-折疊片段。此外，90 ℃/5 min 熱處理的酸馬奶蛋白質(zhì)β-折疊含量為42.52%，較83 ℃/10 min 時(shí)有所降低，而無(wú)規(guī)卷曲顯著增至22.44%，表明在較高強(qiáng)度的熱處理?xiàng)l件下，乳清蛋白變性程度急劇增大，疏水基團(tuán)嚴(yán)重暴露，β-LG 形成更大的熱聚集體，部分β-折疊再次被包裹。從以上結(jié)果推斷，不同熱處理過(guò)程中β-折疊比例變化對(duì)酸馬奶蛋白熱聚集體的聚集程度有重要影響，而蛋白熱聚集體達(dá)到一定量時(shí)，不利于貯藏穩(wěn)定性。

表2 不同熱處理的酸馬奶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例Table 2 Estimated secondary structures of koumiss protein in different thermal treatment degree

3 結(jié)論

酸馬奶在熱加工過(guò)程中，酸度和pH 值未發(fā)生顯著變化的情況下，熱處理能增加體系的黏度和ζ-電位，提高蛋白質(zhì)懸浮穩(wěn)定性。與未熱處理相比，熱處理后的酸馬奶乳清蛋白變性程度和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化，其中β-LG 分子內(nèi)氫鍵被破壞，α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，比例降低，蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的熱聚集。β-折疊的比例變化對(duì)于酸馬奶蛋白熱聚集體聚集程度具有重要影響，隨著熱處理程度的增加，酸馬奶蛋白質(zhì)ζ-電位、離心懸浮量和β-折疊比例均呈先增加后降低的趨勢(shì)，90 ℃/5 min 的熱處理引起β-LG 大量變性，無(wú)規(guī)卷曲比例顯著增加，β-LG 更趨向于自身聚集沉淀，不利于其貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定。在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮酸馬奶蛋白質(zhì)組成的特殊性，研發(fā)相關(guān)酸馬奶產(chǎn)品時(shí)建議盡可能選擇低于90 ℃的熱處理?xiàng)l件，既能提高穩(wěn)定性，又能避免引起不必要的損失。