乳制品中類(lèi)固醇激素類(lèi)化合物檢測(cè)研究進(jìn)展

邢倩倩，劉振民，游春蘋(píng),

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；2.江南大學(xué) 食品營(yíng)養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

乳制品作為代表性的動(dòng)物源食品，能夠提供人體必需的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高，人類(lèi)對(duì)乳制品的需求量急劇增加，乳制品安全問(wèn)題，尤其是獸藥殘留問(wèn)題已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1-2]。獸藥殘留是指動(dòng)物在應(yīng)用獸藥（包括獸藥添加劑）后，蓄積或貯存在細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，或進(jìn)入泌乳動(dòng)物的乳或產(chǎn)蛋家禽蛋中的藥物以及有毒理學(xué)意義的代謝物和藥物雜質(zhì)[3-5]。隨著科技和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)逐漸轉(zhuǎn)向現(xiàn)代集約化和規(guī)?；瑸榱颂岣呓?jīng)濟(jì)效益，類(lèi)固醇激素可能作為促生長(zhǎng)劑被違法添加，用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)增加動(dòng)物體質(zhì)量、提高飼料轉(zhuǎn)化率等[6-7]。

類(lèi)固醇激素又稱(chēng)甾體激素，是一種親脂性的小分子物質(zhì)，主要由內(nèi)分泌腺和分散在其他器官的內(nèi)分泌細(xì)胞等特定器官分泌，是一種微量生物活性物質(zhì)。類(lèi)固醇激素通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)狡渌鞴?，有調(diào)節(jié)、控制組織器官生理活動(dòng)和代謝機(jī)能的作用，并對(duì)各種生理機(jī)能和代謝過(guò)程起著重要的協(xié)調(diào)作用。乳制品中殘留激素通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生一系列健康危害，如導(dǎo)致代謝失調(diào)、生長(zhǎng)發(fā)育障礙和缺陷、出生缺陷、致癌、致畸等[8-9]。乳制品中類(lèi)固醇激素的殘留在國(guó)內(nèi)外已成為獸藥殘留問(wèn)題關(guān)注的重點(diǎn)。

目前已有針對(duì)激素殘留對(duì)消費(fèi)者健康潛在風(fēng)險(xiǎn)的研究。越來(lái)越多的證據(jù)表明，即使是接觸微量的激素類(lèi)物質(zhì)，也可能對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)。雄激素和孕激素均被認(rèn)為是可能對(duì)人類(lèi)致癌的物質(zhì)。歐盟1996年明令禁止畜牧業(yè)使用具有促生長(zhǎng)作用的激素。我國(guó)2019年頒布中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)法令，禁止合成類(lèi)固醇激素在食品動(dòng)物中的應(yīng)用。因此，為保護(hù)人類(lèi)健康免受激素的危害，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧z測(cè)動(dòng)物基質(zhì)中這些化合物的含量。已經(jīng)有研究檢測(cè)了多種生物基質(zhì)，如牛乳、肉、血清、頭發(fā)、皮膚、脂肪和血漿中的激素含量[10-12]。乳制品作為廣泛食用的食品，是研究最多的基質(zhì)之一。

1 類(lèi)固醇激素的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)及其功能

類(lèi)固醇激素結(jié)構(gòu)源于膽固醇，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，由3 個(gè)六元環(huán)和1 個(gè)五元環(huán)構(gòu)成，通過(guò)六元環(huán)-六元環(huán)-六元環(huán)-五元環(huán)的方式排列。類(lèi)固醇激素結(jié)構(gòu)以該類(lèi)化學(xué)骨架為基礎(chǔ)，通過(guò)鏈斷裂、開(kāi)環(huán)或環(huán)收縮形成其他骨架，同樣是C18和C19位置有2 個(gè)甲基，膽固醇脫掉部分側(cè)鏈即為21 個(gè)碳原子的類(lèi)固醇激素-孕激素和腎上腺皮質(zhì)激素，膽固醇脫掉整個(gè)側(cè)鏈即為19 個(gè)碳原子的類(lèi)固醇激素雄性激素，膽固醇脫掉C18位置甲基，第1個(gè)六元環(huán)轉(zhuǎn)化為芳香酚結(jié)構(gòu)形成雌激素；類(lèi)固醇激素的結(jié)構(gòu)區(qū)別主要在于環(huán)形結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)和環(huán)形結(jié)構(gòu)的氧化態(tài)，同時(shí)，類(lèi)固醇結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)的立體異構(gòu)性決定了不同的生物活性，如α-雌二醇和β-雌三醇[13]。

圖1 膽固醇化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of cholesterol

根據(jù)生物活性和藥理作用類(lèi)固醇激素可分為兩大類(lèi)：性激素和腎上腺皮質(zhì)激素（表1）。性激素是由動(dòng)物性腺、腎上腺和調(diào)控器官產(chǎn)生，可促進(jìn)第二性征發(fā)育、性別差異、維持性功能和促進(jìn)動(dòng)物體代謝。性激素可細(xì)分為雌激素、雄激素和孕激素。腎上腺皮質(zhì)激素主要是由哺乳動(dòng)物脊椎腎上腺皮層產(chǎn)生，可細(xì)分為鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素。乳制品生產(chǎn)加工過(guò)程中主要涉及糖皮質(zhì)激素，如氫化可的松、潑尼松龍和地塞米松等。

表1 類(lèi)固醇激素分類(lèi)及代表性激素[5,13-14]Table 1 Classification and representatives of steroid hormones[5,13-14]

類(lèi)固醇激素按照來(lái)源可分為人工合成類(lèi)和天然類(lèi)兩大類(lèi)。天然類(lèi)固醇激素主要由動(dòng)物的雌性、雄性性器官和腎上腺素器官產(chǎn)生，是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)之一。天然類(lèi)固醇激素和人工合成類(lèi)固醇激素均可分為雄激素、雌激素和孕激素。天然激素，如雌二醇、睪酮或孕酮通過(guò)口服或腸道外給藥會(huì)失效。人工合成類(lèi)固醇激素主要用于治療器官病變導(dǎo)致的疾病或用于促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。人工合成類(lèi)固醇激素的給藥途徑與天然激素不同，該類(lèi)激素通常以酯衍生物的形式通過(guò)肌肉注射或耳朵附近植入給藥，經(jīng)過(guò)吸收、水解或異構(gòu)化后，易在體液中轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血；人工合成類(lèi)固醇激素在動(dòng)物體內(nèi)很難分解，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后，可擾亂人體內(nèi)分泌系統(tǒng)[14]。

2 乳制品中類(lèi)固醇激素限量標(biāo)準(zhǔn)

美國(guó)、英國(guó)、中國(guó)等國(guó)家均規(guī)定了動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素的最大殘留量，部分糖皮質(zhì)激素還被規(guī)定為違禁藥物[15]。歐盟規(guī)定，牛的肌肉、肝臟、腎臟和牛乳中潑尼松龍的最大殘留限量分別為4、10、10、6 μg/kg。2020年發(fā)布的中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告235號(hào)法令《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定，地塞米松在牛、豬、馬的肌肉和腎臟中的最大殘留限量為0.75 μg/kg，在肝臟中的最大殘留限量為0.75 μg/kg，在牛乳中的最大殘留限量為0.3 μg/kg[16]。歐盟禁止在食用動(dòng)物中使用氫化可的松。中國(guó)、歐盟和國(guó)際食品法典委員會(huì)并未對(duì)牛乳和其他乳制品中的氫化可的松殘留量設(shè)定限值。日本已制定法規(guī)要求，食品中氫化可的松的最大殘留限量為10 μg/kg。

國(guó)際食品法典委員會(huì)對(duì)醋酸甲羥孕酮在動(dòng)物肝臟中的最大殘留限量設(shè)定為10 μg/kg，對(duì)牛乳中睪酮、孕酮的最大殘留限量未作限制。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局、歐盟規(guī)定，雌激素不可以作為促生長(zhǎng)劑在畜牧業(yè)中使用。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告235號(hào)法令明確規(guī)定：醋酸甲羥孕酮、甲基睪丸酮等為禁用獸藥；苯甲酸雌二醇、丙酸睪酮為治療允許藥物，但不得在牛乳中檢出；雌二醇等雌激素列為禁用藥物，食品中不得檢出。世界衛(wèi)生組織根據(jù)200 mg/d（3.3 mg/kg體質(zhì)量）的最低觀察效應(yīng)水平得出孕酮的可接受每日攝入量（acceptable daily intake，ADI）為30 μg/kg體質(zhì)量[15]。不同國(guó)家、機(jī)構(gòu)針對(duì)牛乳中激素允許的最大殘留限量見(jiàn)表2。

表2 中國(guó)、美國(guó)、歐盟、國(guó)際食品法典委員會(huì)和日本對(duì)牛乳中激素的最大殘留限量比較Table 2 Maximum residue limits for hormones in milk in China, USA,EU, Codex Aalimentarius Commission and Japanμg/kg

3 乳制品中類(lèi)固醇激素檢測(cè)方法

國(guó)內(nèi)外針對(duì)乳制品中類(lèi)固醇激素的研究較多[17-19]，本節(jié)主要討論檢測(cè)方法中的前處理方法和儀器方法。

由于乳制品樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，乳制品中類(lèi)固醇激素的前處理方法主要包括固相萃取、固相微萃取、基質(zhì)固相分散和QuEChERS（quick, easy, cheap, effective,rugged, safe）等[20-24]。

類(lèi)固醇激素的檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫法和色譜分析法，其中酶聯(lián)免疫法假陽(yáng)性率高，只能用于定性初篩[25]。Kolanvic等[26]驗(yàn)證了酶聯(lián)免疫法篩查對(duì)牛乳中地塞米松、倍他米松、氟米松和潑尼松龍4 種激素的有效性。色譜分析法可用于類(lèi)固醇激素的精準(zhǔn)定量，主要包括高效液相色譜-串聯(lián)紫外色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[27]。Qin Hui等[28]采用高效液相色譜-串聯(lián)紫外色譜法分析牛乳樣品中的3 種腎上腺皮質(zhì)激素（二丙酸倍氯米松、丁酸氫化可的松和苯丙酸諾龍）。劉東等[29]采用通過(guò)式固相萃取對(duì)牛乳和乳粉中4 種類(lèi)固醇激素進(jìn)行前處理，然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛乳和乳粉中4 種類(lèi)固醇激素，檢出限為0.4～2.0 μg/kg，定量限為0.8～4.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為85%～115%。田海偉等[30]通過(guò)QuEChERS前處理方法，實(shí)現(xiàn)牛乳中18 種糖皮質(zhì)激素的同時(shí)檢測(cè)，然后通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行定性和定量分析，實(shí)現(xiàn)牛乳中18 種糖皮質(zhì)激素的同時(shí)檢測(cè)。該方法的基質(zhì)效應(yīng)為0.81～0.96，方法檢出限為0.1～0.3 μg/kg，定量限為0.3～1.1 μg/kg，0.5～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，3 個(gè)水平下加標(biāo)回收率為73.7%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～12.9%（n=5）。該方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確、可靠，適合于大批量牛乳樣品中糖皮質(zhì)激素的快速檢測(cè)。D’Orazio等[31]采用中空纖維液相微萃取法及氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定牛乳和酸乳樣品中的雌激素化合物，方法校準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)大于0.991，全脂牛乳的檢測(cè)限和定量限分別為0.06～2.55 μg/L和0.16～6.11 μg/L，半脫脂山羊乳的檢測(cè)限和定量限分別為0.04～1.70 μg/L和0.11～4.86 μg/L，天然酸乳的檢測(cè)限和定量限分別為0.07～3.73 μg/L和0.23～9.81 μg/L。

色譜分析法檢測(cè)準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，尤其是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前類(lèi)固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法?，F(xiàn)有的3 項(xiàng)有關(guān)類(lèi)固醇激素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 21981—2008《動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1—2008《動(dòng)物源性食品中11 種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2—2008《動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物多殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法完成定量。

4 乳制品中類(lèi)固醇激素含量研究進(jìn)展

Chen Chen等[32]對(duì)北京市售乳制品中天然存在的雌激素含量展開(kāi)研究，選擇26 個(gè)品類(lèi)超高溫滅菌（ultrahigh temperature，UHT）乳、4 個(gè)品類(lèi)巴氏殺菌乳、6 個(gè)品類(lèi)嬰幼兒配方乳粉和2 個(gè)品類(lèi)全脂乳粉。結(jié)果表明：不同乳制品中雌酮含量為：UHT牛乳3.52～19.36 ng/L，巴氏殺菌乳小于檢測(cè)限，為22.49 ng/L，嬰兒配方乳粉26.78～146.12 ng/L，全脂乳粉10.35～10.38 ng/L；17α-雌二醇含量為：UHT牛乳0.95～12.61 ng/L，巴氏殺菌乳小于檢測(cè)限，為28.24 ng/L，嬰兒配方乳粉7.98～35.00 ng/L，全脂乳粉24.27～28.34 ng/L；17β-雌二醇含量為：UHT牛乳小于檢測(cè)限，為36.00 ng/L，巴氏殺菌乳小于檢測(cè)限，為44.24 ng/L，嬰兒配方乳粉19.16～37.72 ng/L，全脂乳粉58.59～70.12 ng/L；雌三醇含量為：UHT牛乳小于檢測(cè)限，為2.18 ng/L，巴氏殺菌乳、嬰兒配方乳粉和全脂乳粉均小于檢測(cè)限。陳曉鵬等[16,33]采用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)中國(guó)市場(chǎng)銷(xiāo)售的24 個(gè)乳粉樣品和24 個(gè)牛乳樣品進(jìn)行42 種類(lèi)固醇激素殘留量檢測(cè)，結(jié)果顯示，48 個(gè)乳制品中除了孕酮外其他41 種類(lèi)固醇激素均未檢出，其中乳粉中孕酮的檢出量為0.6～23.8 μg/kg，牛乳中孕酮的檢出量為0.3～0.8 μg/kg。韓超男等[34]采用同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法完成20 份牛乳中睪酮、孕酮及氫化可的松3 種類(lèi)固醇激素的檢測(cè)，20 份牛乳樣品中均含有孕酮，含量為1.33～16.19 μg/kg，19 份牛乳樣品中檢出氫化可的松，含量為0.14～1.02 μg/kg，未超出國(guó)家規(guī)定的10 μg/kg限量標(biāo)準(zhǔn)，樣品均未檢出睪酮?？嫡际35]建立凝膠凈化色譜-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定乳粉中的潑尼松、波尼松龍、氫化可的松、地塞米松和倍他米松含量，15 種乳粉中均未檢測(cè)到以上化合物；建立嬰幼兒配方乳粉中6 種雌激素（已烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇和雌酮）的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，26 份嬰幼兒配方乳粉中17α-雌二醇的含量為0.10～4.49 μg/kg，1 個(gè)樣品中檢出17β-雌二醇，含量為0.17 μg/kg，3 個(gè)樣品中檢出雌三醇，含量均為0.19 μg/kg，未檢出己烯雌酚、雌酮和炔雌醇。

不同乳制品中類(lèi)固醇激素含量見(jiàn)表3。

表3 不同乳制品中類(lèi)固醇激素含量Table 3 Contents of steroid hormones in different dairy products

5 乳制品中類(lèi)固醇激素健康風(fēng)險(xiǎn)研究

乳制品中的激素對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)生理功能會(huì)有一定影響，已引起科研界和工業(yè)界的關(guān)注[37]。在乳制品中類(lèi)固醇激素對(duì)健康風(fēng)險(xiǎn)研究方面，已有一些研究報(bào)道可供參考。Qu Xueyin等[36]對(duì)河北省唐山市原料乳中天然存在的類(lèi)固醇激素健康風(fēng)險(xiǎn)開(kāi)展調(diào)查?；谠撗芯克脭?shù)據(jù)，當(dāng)暴露于該研究中檢測(cè)的牛乳中類(lèi)固醇激素（僅檢測(cè)到氫化可的松和孕酮）濃度時(shí)，預(yù)計(jì)1～5 歲的兒童將成為高危人群。根據(jù)牛乳中檢測(cè)到的氫化可的松孕酮平均濃度和最大濃度，以及男孩和女孩每日攝入量估算，結(jié)果表明，所檢測(cè)的原料乳中類(lèi)固醇激素濃度不會(huì)對(duì)幼兒構(gòu)成健康風(fēng)險(xiǎn)。Chen Chen等[32]對(duì)北京市售乳制品中天然存在的雌激素的潛在暴露風(fēng)險(xiǎn)開(kāi)展初步評(píng)估?；谒鶛z測(cè)的不同乳制品中雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇和雌三醇濃度計(jì)算出通過(guò)牛乳攝入的雌激素暴露量和毒理學(xué)關(guān)注閾值分別為99～1 700 000和6.1～3 177，以確定來(lái)自牛乳的雌激素?cái)z入量是否符合毒理學(xué)限制要求。結(jié)果表明，牛乳中可能存在的單個(gè)雌激素和總雌激素不會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)鼐用瘢òㄓ變海┰斐山】碉L(fēng)險(xiǎn)。

6 結(jié) 語(yǔ)

本文系統(tǒng)介紹了類(lèi)固醇激素的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)及功能，乳制品中類(lèi)固醇激素檢測(cè)方法、限量標(biāo)準(zhǔn)、含量及健康風(fēng)險(xiǎn)研究進(jìn)展。隨著高效前處理技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，類(lèi)固醇激素檢測(cè)方法近些年有較大突破。近年來(lái)，QuEChERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法成為使用最廣泛的技術(shù)。乳制品中類(lèi)固醇含量較低，開(kāi)發(fā)高靈敏度的檢測(cè)方法仍是今后主要研究目標(biāo)。

近期研究主要基于美國(guó)、歐盟、中國(guó)等國(guó)家和組織針對(duì)類(lèi)固醇激素所制定的限量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)所檢測(cè)乳制品中類(lèi)固醇激素含量，研究不同人群的暴露風(fēng)險(xiǎn)。由于乳制品中類(lèi)固醇激素檢出類(lèi)別較少，暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估覆蓋面較小。開(kāi)發(fā)具有高靈敏度的檢測(cè)方法，可增加類(lèi)固醇激素的檢出類(lèi)別，進(jìn)而增加暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估覆蓋面。