白 楊，梁 軒，杜雷雷，高藝欣，李先先，穆明東，何進(jìn)偉

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

手足口病(hand,foot and mouth disease，HFMD)是由小核糖核酸病毒科病毒引起的一種病毒性疾病，5歲以下兒童多見(jiàn)，傳染性強(qiáng)[1]，初始表現(xiàn)為發(fā)熱和不適，1～2 d后手、腳及唇可出現(xiàn)扁平變色斑點(diǎn)或腫塊，可發(fā)展為水泡，臀部及腹股溝偶見(jiàn)。癥狀和體征一般在感染病毒后3～6 d出現(xiàn)，多數(shù)患兒1星期后自愈，少數(shù)可出現(xiàn)并發(fā)癥，如心肌炎、無(wú)菌性腦膜腦炎等。機(jī)體體液與細(xì)胞免疫功能對(duì)HFMD病情發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有重要作用，并對(duì)指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后有一定意義[2]。我們探討了HFMD患兒體液與細(xì)胞免疫指標(biāo)改變的臨床意義，以期為臨床判斷病情及采取干預(yù)措施提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019-10—2021-01月延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的80例HFMD患兒，其中男43例，女37例；年齡4～18月，平均12.6月。均符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)健委《手足口病診療指南(2018年版)》[3]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分為輕型組38例和重癥組42例。選取同年齡段正常兒童40例為對(duì)照組。3組兒童性別、年齡等一般情況資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)延安大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，研究?jī)?nèi)容患兒家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本收集

抗凝管采集空腹外周靜脈血2～3 mL待測(cè)。采集空腹外周靜脈血2～3 mL室溫靜置1 h凝固后，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清置-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)外周靜脈血T淋巴細(xì)胞亞群，熒光標(biāo)記抗體試劑亦購(gòu)自BD公司。取50 μL外周血標(biāo)本與相應(yīng)于各T細(xì)胞亞群熒光單克隆抗體10 μL充分混勻，室溫下避光孵育15 min，加入250 μL溶血素充分混勻，置37 ℃水浴15 min，加入PBS緩沖液250 μL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育15 min，加入PBS緩沖液1 mL，振蕩混勻，1 800 r·min-1室溫離心5 min，棄上清液，加入PBS緩沖液250 μL，振蕩混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群和B淋巴細(xì)胞亞群。

體液免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼AU2700，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)行散射比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白(IgG 、IgA 和IgM)及C3和C4；應(yīng)用伯樂(lè)酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國(guó)伯樂(lè)公司)行酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6、INF和TNF-α。檢測(cè)試劑分別購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司和北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司。按照相關(guān)使用說(shuō)明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞免疫指標(biāo)變化比較

正常對(duì)照組兒童外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+，CD4+，CD8+)檢測(cè)值及CD4+/CD8+比值與正常參考值基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。HFMD輕型組和重癥組患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，重癥組比輕型組下降更為明顯(P<0.05)；輕型組和重癥組外周血CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞亞群比值亦比對(duì)照組有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表1 對(duì)照組兒童外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)值

表2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.2 體液免疫指標(biāo)變化比較

HFMD患兒血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平均高于對(duì)照組且隨病情加重而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；血清C3和C4含量低于對(duì)照組且隨病情加重下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

表3 血清免疫球蛋白水平及補(bǔ)體含量比較

2.3 血清炎癥細(xì)胞因子水平變化比較

HFMD患兒血清炎癥細(xì)胞因子IL1、IL6和TNFα水平均較對(duì)照組升高且隨病情加重進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；INF水平較對(duì)照組降低且隨病情加重進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表4)。

表4 血清炎癥細(xì)胞因子水平比較

3 討 論

HFMD傳染性極強(qiáng)，起病急、發(fā)展快，于1957年在新西蘭首次報(bào)道，東南亞發(fā)生過(guò)幾次大暴發(fā)流行。小核糖核酸病毒科多種腸道病毒特別是腸道病毒71型和柯薩奇病毒是引起兒童HFMD的常見(jiàn)病原體[1]。臨床表現(xiàn)常見(jiàn)發(fā)熱、四肢末端及口腔等部位斑丘疹和皰疹，病情一般持續(xù)1周后痊愈，亦可能發(fā)展形成重癥。重癥晚期可能出現(xiàn)心肺和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[4]，部分患者會(huì)留下后遺癥，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致死亡[5]。在我國(guó)，2008年局部地區(qū)首次發(fā)生腸道病毒71型引起的HFMD暴發(fā)；2012年由柯薩奇病毒引起的HFMD暴發(fā)疫情數(shù)增高，可能與部分地區(qū)柯薩奇病毒A6型發(fā)生變異使易感人群增加有關(guān)；2016年出現(xiàn)HFMD流行小高峰[6]；2018-05月HFMD被我國(guó)納入法定傳染病管理[7]。

目前研究認(rèn)為，細(xì)胞免疫和體液免疫均在HFMD病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[2,8]。由于幼兒免疫功能發(fā)育尚不健全，特異性及非特異性免疫功能均處于較低狀態(tài)，易受病毒感染，在對(duì)抗病毒感染時(shí)CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞會(huì)被消耗，從而使細(xì)胞免疫功能更加降低，所以幼兒很易患HFMD；而且低齡兒童感染HFMD后，重癥或危重癥發(fā)生率及病死率均相對(duì)較高[9]。T淋巴細(xì)胞主要為細(xì)胞免疫并輔助體液免疫和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，T淋巴細(xì)胞(CD3+)及其亞群(CD4+、CD8+)的相對(duì)比值可反映人體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。CD3+細(xì)胞代表機(jī)體總T淋巴細(xì)胞，CD3+T淋巴細(xì)胞水平降低表明人體免疫功能狀態(tài)低下。T淋巴細(xì)胞亞群執(zhí)行不同的免疫功能，其中CD4+細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞，可通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)或輔助其他免疫細(xì)胞的活性；CD8+細(xì)胞主要是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，具有直接殺傷病毒感染的靶細(xì)胞的作用[10-12]。HFMD患兒CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞水平下降提示T淋巴細(xì)胞功能受損，患兒免疫系統(tǒng)紊亂嚴(yán)重[13]。B淋巴細(xì)胞亞群發(fā)揮體液免疫功能，活化的B細(xì)胞能夠作為抗原呈遞細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞呈遞抗原，活化后輔助性T細(xì)胞激活B淋巴細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞而分泌抗體發(fā)揮體液免疫功能[10]。IgM抗體在機(jī)體特異性免疫防御中最先出現(xiàn)；IgA抗體主要在黏膜局部發(fā)揮免疫作用，能夠阻止病毒吸附細(xì)胞；IgG抗體除具有中和病毒作用外還能間接殺傷病毒感染的細(xì)胞[11]?；純喊l(fā)病時(shí)，機(jī)體體液免疫被激活，抵御病原體侵襲的能力降低，導(dǎo)致大量抗體產(chǎn)生。補(bǔ)體作為固有免疫機(jī)制在抗病毒感染中也發(fā)揮重要作用，機(jī)體中血清補(bǔ)體能夠通過(guò)相關(guān)途徑直接參與免疫應(yīng)答，溶解免疫球蛋白復(fù)合物達(dá)到抗病毒的作用，同時(shí)還能直接中和、溶解病毒，HFMD患兒補(bǔ)體水平下降可能與其參與免疫應(yīng)答后大量消耗有關(guān)[14]。多數(shù)免疫細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子發(fā)揮功能或調(diào)節(jié)機(jī)體其他細(xì)胞毒反應(yīng)，細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞因子水平的改變可反應(yīng)機(jī)體免疫或病理狀態(tài)[15-16]。

多項(xiàng)研究表明，HFMD患兒體液免疫與細(xì)胞免疫功能下降與病情嚴(yán)重程度相關(guān)[17-20]，本研究結(jié)果表明，HFMD患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD8+水平均低于正常兒童，重癥組水平更低；血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平均高于對(duì)照組且隨病情加重進(jìn)一步升高；C3和C4含量卻隨病情加重而下降；血清炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF-α水平均比正常對(duì)照組升高并且隨病情加重而升高，INF含量比正常對(duì)照組下降并隨病情加重而下降更顯著，可能因病情加重導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，機(jī)體免疫能力降低，血清補(bǔ)體消耗增加所致。

綜上，HFMD患兒細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)均較正常兒童有較大變化，且隨病情進(jìn)展變化幅度增大，可為臨床判斷病情嚴(yán)重程度及采取干預(yù)措施提供一定參考依據(jù)。