馬嘉楠, 李 蕊, 鄒 嶸, 張 鳳

(蘭州大學(xué) 生態(tài)創(chuàng)新研究院,甘肅 蘭州 730070)

在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中,植物為了適應(yīng)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境,進(jìn)化出多種形式的植物-微生物共生體系,其中最重要的體系就是植物根系和土壤真菌形成的互利共生的聯(lián)合體—菌根[1]。根據(jù)菌根形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)特征,菌根可以分為三種主要類型：內(nèi)生菌根、外生菌根和內(nèi)外生菌根[2],目前全世界共有7 750多種外生菌根真菌和200余種叢枝菌根真菌[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,外生菌根真菌不僅能幫助促進(jìn)植物生長增加植物生物量,還能提高葉綠素的含量與凈光合速率,刺激植物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物,調(diào)節(jié)激素平衡,促進(jìn)植物生長,增強(qiáng)植物抗逆性、適應(yīng)性與吸收能力,在改善土壤微生物環(huán)境方面也具有重要意義,是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分[4-9]。外生菌根中植物主要為真菌提供碳源,真菌為植物提供主要的氮、磷等營養(yǎng)元素[1]。外生菌根和植物宿主相互作用機(jī)制的研究,一方面受限于外生菌根共培養(yǎng)體系的建立,另一方面則受限于外生菌根真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[10]。因此,建立高效的真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系尤為重要。外生菌根真菌功能的研究需要高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)[11]是植物科學(xué)中的一種成熟技術(shù),同樣也為真菌遺傳學(xué)開啟了一個(gè)新時(shí)代。在過去的20年里,熒光標(biāo)記物的使用提供了大量的信息,涵蓋了真菌生物學(xué)的各個(gè)方面,在真菌細(xì)胞與植物組織相互作用時(shí)的可視化[12]等方面具有重要作用,例如與植物組織相互作用時(shí)可視化真菌細(xì)胞等[13],揭示了特定真菌蛋白和細(xì)胞過程在植物與病原體相互作用中的重要性[14-18]。外生菌根真菌及其共生植物的類群龐雜,其共生過程缺乏共性,給研究帶來了難度。雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor(Maire P.D.Orton))是擔(dān)子菌亞門(Basidiomycatina)口蘑科(Tricholomataceae)蠟?zāi)?Laccaria)的優(yōu)良外生菌根真菌[19],存在于植物根際土壤中[20],在森林、成熟苗圃中十分常見[21]。隨著雙色蠟?zāi)⒒蛐蛄械耐瓿?越來越多的研究者開始以雙色蠟?zāi)槟Ｊ缴镅芯客馍婢c植物的作用機(jī)制。對(duì)于外生菌根與外生菌根真菌的分子機(jī)理、調(diào)節(jié)機(jī)制的研究仍有待進(jìn)一步完善,深入研究該機(jī)制有助于理解外生菌根及其在整個(gè)自然生態(tài)循環(huán)中的作用,使得外生菌根真菌能夠有目的地轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力并在生態(tài)修復(fù)中發(fā)揮作用。因此,選擇外生菌根真菌模式生物雙色蠟?zāi)?gòu)建外生菌根真菌攜帶熒光蛋白轉(zhuǎn)化子具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 本研究所用的pCEBN載體、pHg載體以及LaccariabicolorS238N(Maire P.D.Orton)均由法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院Francis Martin院士惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①M(fèi)MN固體培養(yǎng)基(Melin Norkrans medium,MMN)：Thiamine 0.05,CaCl20.05,NaCl 0.025,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.15,(NH4)2HPO40.25,FeSO4·7H2O 0.001,葡萄糖 10,麥芽糖提取物 3,酵母提取物 0.5,pH 5.8,用于固體平板培養(yǎng)時(shí),加入瓊脂15;②P5培養(yǎng)基(篩選培養(yǎng)基)：酒石酸銨0.5,Thiamine 0.05,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,葡萄糖 20,麥芽糖 5,pH 5.8,用于固體平板培養(yǎng)時(shí),加入瓊脂15;③共培養(yǎng)培養(yǎng)基(農(nóng)桿菌侵染真菌培養(yǎng)基)：Thiamine 0.05,CaCl20.05,NaCl 0.025,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.15,(NH4)2HPO40.25,葡萄糖 2,麥芽提取物 3,酵母提取物 0.5,MES 40 mmol/L,甘油 5,pH 5.3,用于固體平板培養(yǎng)時(shí),加入瓊脂15。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Fisher公司;連接酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自南京Vazyme公司;試劑購自上海生工公司;本實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。高壓滅菌鍋(GI80TW作ZEALWAY);搖床(MQD-S2NR,旻泉);PCR儀(Bio Rad T100,伯樂);核酸電泳儀(DYCP-31DN,北京六一);生化培養(yǎng)箱(LRH-250,上海一恒科學(xué)儀器);激光共聚焦顯微鏡(FV3000,Olympus)。

表1 實(shí)驗(yàn)引物

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 以野生型雙色蠟?zāi)DNA為模板,選擇Kemppainen研究中的pCEBN∷mCherry載體,mCherry為雙色蠟?zāi)⒌臉?biāo)記蛋白[22]構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒。使用引物：H2B-F-StuⅠ+H2B-R-XmaⅠ (表1)擴(kuò)增目的基因條帶連接T載體后測(cè)序,測(cè)序正確的質(zhì)粒以StuⅠ和XmaⅠ為酶切位點(diǎn),定向克隆連接到pCEBN∷mCherry載體上;然后使用SacⅠ酶切連接穿梭載體pHg,圖1為pHg-pCEBN∷mCharry-H2B的質(zhì)粒構(gòu)建圖。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株AGL-1,挑取固體培養(yǎng)基平板上的農(nóng)桿菌單克隆,液體搖菌培養(yǎng),并再次用載體引物mch/GFP-F+R與潮霉素抗性引物(表1)菌檢,選取驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌菌液侵染真菌。

圖1 pHg-pCEBN∷mCherry-H2B質(zhì)粒構(gòu)建圖Fig.1 pHg-pCEBN∷mCherry H2B-plasmid construction diagram

1.2.2 侵染真菌 使用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,使用農(nóng)桿菌株系A(chǔ)GL-1;使用Kemppainen等[23]研究的根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化真菌：選用真菌培養(yǎng)廣泛使用的MMN培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的野生型L.bicolor作為侵染材料,侵染液濃度至OD600=0.4～0.6,加入200 μmol/L的乙酰丁香酮(AS);將侵染液滴加到真菌上,使真菌與農(nóng)桿菌置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上,共培養(yǎng)培養(yǎng)基中同樣含有利于轉(zhuǎn)化的乙酰丁香酮(AS),正置暗培養(yǎng)4 d,24 ℃。

1.2.3 篩選轉(zhuǎn)化子 使用營養(yǎng)豐富的P5培養(yǎng)基加抗生素篩選,經(jīng)過第1輪、第2輪篩選培養(yǎng)基(P5培養(yǎng)基含頭孢霉素500 μg/mL和潮霉素300 μg/mL)與第3輪篩選培養(yǎng)基(P5培養(yǎng)基含潮霉素150 μg/mL)篩選后選出15個(gè)真菌轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子 外生菌根真菌雙色蠟?zāi)⒒蚪M提取參考十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取真菌基因組[24]。

1.2.5 真菌生長表型 將MMN培養(yǎng)基生長7 d的雙色蠟?zāi)Hg-pCEBN∷mCherry-H2B與野生型菌絲進(jìn)行對(duì)比,觀察生長速度、菌絲形態(tài)與邊緣菌絲生長狀況等。

1.2.6 雙色蠟?zāi)⒕z染色觀察 在培養(yǎng)基上取生長周期7 d的菌圈邊緣新鮮的雙色蠟?zāi)⒕z,用多聚甲醛固定樣品4 h后,使用PBS溶液清洗3遍;將固定好的菌絲切片用10 μg/mL的小麥凝集素(WGA染料)染色30 min;染色標(biāo)本在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 使用Image J測(cè)量菌落直徑,使用Origin 2018、PhotoshopCS6 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建pHg-pCEBN∷mCherry-H2B質(zhì)粒

2.1.1 目的基因擴(kuò)增 選擇核小體核心組蛋白H2B家族作為目的基因檢測(cè)熒光蛋白在雙色蠟?zāi)⒅械谋磉_(dá),H2B存在許多亞型,在這5個(gè)Laccaria組蛋白H2B基因模型中,作為功能作用的基因HTB16201和HTB162022是典型的復(fù)制依賴的組蛋白亞型,選擇其中的HTB16202作為雙色蠟?zāi)⒅袩晒獾鞍锥ㄎ槐磉_(dá)的檢測(cè)基因[22]。與天然組蛋白類似,組蛋白-熒光蛋白的融合被證明也能進(jìn)入核小體[25],因此,熒光蛋白在細(xì)胞的所有有絲分裂階段都定位于細(xì)胞核。以外生菌根雙色蠟?zāi)DNA為模板,H2B-F和H2B-R為引物擴(kuò)增得到兩端分別帶有StuⅠ和XmaⅠ限制性酶切位點(diǎn)的H2B基因(圖2A),連接T載體后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,通過與序列比對(duì),結(jié)果顯示,序列匹配度為100%。將H2B的片段克隆到中間載體pCEBN,構(gòu)建pHg-pCEBN∷mCherry-H2B后,轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL1中進(jìn)行后續(xù)真菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(圖2B、C)。

圖2 目的基因擴(kuò)增Fig.2 Target gene amplificationA：LbH2B目的基因擴(kuò)增;B：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B構(gòu)建質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增;C：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B農(nóng)桿菌的PCR擴(kuò)增;M：2 000 bp DNA Marker;1：H2B基因全長441 bp;2、3：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B構(gòu)建質(zhì)粒;4、5：陰性對(duì)照野生型gDNA;6、7：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B農(nóng)桿菌;8、9：陰性對(duì)照空白AGL-1菌液;2、4、6、8使用引物為mch/GFP-F+R;3、5、7、9使用潮霉素抗性引物A：LbH2B target gene amplification; B：PCR amplification of pHg-pCEBN∷mCherry-H2B plasmid; C：PCR amplification of pHg-pCEBN∷mCherry-H2B Agrobacterium; M：2 000 bp DNA Marker; 1： H2B gene full length, about 441 bp; 2, 3： pHg-pCEBN∷mCherry-H2B plasmid; 4, 5： Wild-type gDNA negative control; 6, 7： pHg-pCEBN∷mCherry-H2B Agrobacterium; 8, 9：Negative control blank AGL-1 bacterial liquid; 2, 4, 6, 8 using the primer mch/GFP-F+R; 3, 5, 7, 9 using the hygromycin B primer

2.2 菌根真菌的轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,對(duì)真菌的菌絲進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。首先利用抗生素進(jìn)行篩選,兩輪篩選后隨機(jī)挑選15個(gè)真菌轉(zhuǎn)化子使用CTAB法提取DNA,潮霉素抗性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)15個(gè)隨機(jī)挑選的真菌轉(zhuǎn)化子中,有14個(gè)真菌轉(zhuǎn)化子的基因組DNA擴(kuò)增出大小750 bp左右與潮霉素抗性基因片段長度相同,而野生型(NC)的基因組卻沒有相應(yīng)的條帶(圖3)。于是計(jì)算出該方法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)93.33%。14個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子中,3號(hào)轉(zhuǎn)化子與15號(hào)條帶較淺,1號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、12號(hào)和14號(hào)條帶較亮,推測(cè)15號(hào)轉(zhuǎn)化子中H2B表達(dá)較弱,1號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、12號(hào)和14號(hào)轉(zhuǎn)化子中H2B基因表達(dá)較強(qiáng)。因此選擇真菌轉(zhuǎn)化LbH2B-1、6、7、12進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖3 LbH2B轉(zhuǎn)化子潮霉素抗性基因鑒定Fig.3 Identification of Hygromycin resistance gene in pHg-pCEBN∷mCherry-H2B transformantsM：2 000 bp DNA Marker;NP：野生型雙色蠟?zāi)?gDNA,陰性對(duì)照;PC：陽性質(zhì)粒pHg-pCEBN∷mCherry;1～15：轉(zhuǎn)化子M：2 000 bp DNA Marker; NP：WT gDNA, negative control; PC：Positive plasmid pHg-pCEBN∷mCherry; 1-15：Transformants

2.3 真菌生長表型

在MMN培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的雙色蠟?zāi)⒁吧?圖4A)與LbH2B∷mCherry(LbH2B)真菌轉(zhuǎn)化子(圖4B～4E)的生長情況沒有區(qū)別：野生型菌落的平均直徑為702 mm,LbH2B-1轉(zhuǎn)化子真菌菌落的平均直徑為726 mm,LbH2B-6真菌菌落的平均直徑為715 mm,LbH2B-7真菌菌落的平均直徑693 mm,LbH2B-12真菌菌落的平均直徑為696 mm。而且野生型與轉(zhuǎn)化子間生長速度相近,真菌生長形態(tài)沒有區(qū)別。實(shí)驗(yàn)表明雙色蠟?zāi)⑥D(zhuǎn)化子LbH2B和紅色熒光蛋白融合表達(dá)后不會(huì)影響真菌的生長狀態(tài)。

圖4 雙色蠟?zāi)⒕湫螒B(tài)Fig.4 Colony morphological diagram of L. bicolorA：雙色蠟?zāi)⒁吧?B：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-1轉(zhuǎn)化子;C：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-6轉(zhuǎn)化子;D：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-7轉(zhuǎn)化子;E：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-12 轉(zhuǎn)化子A：WT;B：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-1 strain;C：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-6 strain;D：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-7 strain;E：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-12 strain

2.4 陽性真菌轉(zhuǎn)化子的紅色熒光蛋白信號(hào)觀察

為了檢測(cè)融合熒光蛋白的表達(dá)情況,利用共聚焦激光顯微鏡對(duì)真菌菌絲進(jìn)行觀測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),這四個(gè)陽性的真菌轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞核中均有紅色熒光信號(hào)(圖5),而野生型卻沒有熒光信號(hào)。結(jié)果表明,本研究成功將核小體H2B蛋白和紅色熒光蛋白融合后,轉(zhuǎn)入外生菌根真菌雙色蠟?zāi)⒅?并穩(wěn)定表達(dá),證明了融合熒光蛋白在真菌分子機(jī)制可視化研究中的可行性。

圖5 雙色蠟?zāi)⒕z共聚焦顯微鏡圖Fig.5 Laser scanning confocal microscopy image of L.bicolor hyphae圖中綠色為真菌菌絲,紅色為熒光蛋白;GFP：488 nm波長熒光;mCherry：561 nm波長熒光;BF：明場(chǎng);OVERLAP：疊加場(chǎng)green：Fungal hyphae, red：Fluorescent protein; GFP：Fluorescence at 488 nm wavelength, mCherry： Fluorescence at 561 nm wavelength, BF： Bright field, OVERLAP： Overlay field

3 討 論

外生菌根真菌分子機(jī)制的研究建立在高效的外生菌根真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上[10],本研究建立了陽性率達(dá)到90%以上高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系,得到了核小體蛋白和紅色熒光蛋白融合表達(dá)的轉(zhuǎn)化子真菌。在真菌中,熒光蛋白除了在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)外,還成功地靶向了不同的細(xì)胞器,例如細(xì)胞核、質(zhì)膜、過氧化物酶體、線粒體、ER內(nèi)腔和高爾基體[26-28],本研究選擇雙色蠟?zāi)⒑诵◇w核心組蛋白H2B和紅色熒光蛋白融合表達(dá),成功將熒光蛋白定位到細(xì)胞核中。在Kemppainen等[22]研究中也證實(shí),紅色熒光蛋白的性能優(yōu)于綠色熒光蛋白,可以產(chǎn)生更持久的熒光信號(hào),并且紅色熒光的檢測(cè)波長范圍內(nèi)菌絲自發(fā)熒光現(xiàn)象最微弱。本研究中選擇小麥胚凝集素(WGA)對(duì)菌絲染色,小麥凝集素可特異性識(shí)別與結(jié)合真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)[29],該染料帶有Alexe flour 488的顯色基團(tuán),很容易在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色的真菌菌絲,更好地觀察真菌菌絲的分布。組蛋白-熒光蛋白融合物與天然蛋白相似[30],可通過細(xì)胞中的所有有絲分裂期定位于細(xì)胞核中更方便可視化,在植物[31-32]和動(dòng)物中已成功地表達(dá)了典型的組蛋白H2B-熒光蛋白融合體[33-36],本研究成功地以H2B作為目的基因,很好地觀察融合熒光蛋白的亞細(xì)胞定位,為后續(xù)研究基因的亞細(xì)胞定位提供了很好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

根瘤農(nóng)桿菌是一類普遍存在的革蘭陰性細(xì)菌,通過將克隆載體將目的片段插入到自身Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū),最終將T-DNA片段整合到寄主的基因組中[37],使用的農(nóng)桿菌株系為AGL-1,研究表明外生菌根真菌常用的農(nóng)桿菌菌株有AGL-1和LBA4404,在雙色蠟?zāi)⒅蠥GL-1的轉(zhuǎn)化效率比LBA4404高出4倍[11];由于較高的轉(zhuǎn)化效率,AGL-1在真菌遺傳轉(zhuǎn)化中使用較多,Kemppainen等[22]在研究中也使用AGL-1農(nóng)桿菌,但并未表明轉(zhuǎn)化效率。本研究轉(zhuǎn)化效率為93.33%,與其他雙色蠟?zāi)⑦z傳轉(zhuǎn)化效率相比較高[38],并突出了熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)。影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的因素有很多,包括農(nóng)桿菌菌株株系、受體材料、目的載體構(gòu)建、誘導(dǎo)劑濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度等[10]。農(nóng)桿菌生長狀態(tài)需要處于對(duì)數(shù)期,即活力最強(qiáng)時(shí)期;為提高轉(zhuǎn)化效率需在重懸液中加入乙酰丁香酮作為誘導(dǎo)劑,Satish等[39]在沙漠松露(Terfeziaboudieri)轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)如果不添加乙酰丁香酮轉(zhuǎn)化率幾乎為零,且最適宜濃度為200 μmol/L。受體材料前期培養(yǎng)中,本研究使用MMN培養(yǎng)基區(qū)別于Kemppainen在培養(yǎng)真菌時(shí)使用的P5培養(yǎng)基,DNA篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn),此方法對(duì)外生菌根真菌的侵染,陽性率較高,能篩選到陽性轉(zhuǎn)化子高達(dá)90%以上,得到了更好的轉(zhuǎn)化效率。

綜上所述,本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染真菌,獲得了極高的轉(zhuǎn)化效率;篩選獲得核小體和熒光蛋白融合表達(dá)菌根真菌菌株LbH2B,真菌轉(zhuǎn)化子并不影響菌絲的生長狀態(tài);利用激光共聚焦顯微鏡清晰地觀察到菌絲細(xì)胞核中的紅色熒光。本研究成功地建立了融合表達(dá)熒光蛋白的菌根真菌轉(zhuǎn)化體系,為后續(xù)研究其他基因在菌根真菌中的功能提供了技術(shù)平臺(tái)。在以后的研究中,可將本研究建立的熒光蛋白融合體系用于后續(xù)的基因亞細(xì)胞定位分析,特別是真菌啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)分析,為揭示菌根形成中的信號(hào)分子交流機(jī)制提供參考。