陳 飛, 韓 冰, 于廣峰, 鐘麗娟, 柴林山, 郭玲玲

(遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000)

紅托竹蓀(Dictyophorarubrovolvata)屬真菌界擔子菌亞門(Basidiomycotina)腹菌綱(Gasteromycetes)鬼筆目(Phallales)鬼筆科(Phallaceae)竹蓀屬(Dictyophora),是一種名貴食藥兩用真菌。因其外形有一層獨特的形如傘狀的菌裙,有“雪裙仙子”之稱,被譽為菌中皇后。紅托竹蓀子實體和竹蓀蛋中富含大量的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2],具有抗氧化、抗糖化、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[3],口感清鮮脆嫩、風味獨特,營養(yǎng)豐富,受到廣大消費者的喜愛,有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值,自古就被列為“草八珍”之一[4-7]。隨著紅托竹蓀市場需求的擴大,提高產(chǎn)量和提升品質(zhì)成為紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)面臨的主要問題,而篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的紅托竹蓀菌種是解決問題的有效方法[8-12]。本研究依據(jù)紅托竹蓀菌種生長過程營養(yǎng)需求,制備紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基,并通過響應面法進行培養(yǎng)基優(yōu)化,優(yōu)化的紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基不僅可以提高紅托竹蓀組織分離菌種生長速度,縮短時間、提高菌種分離效率,還可以滿足紅托竹蓀菌種對淀粉、木質(zhì)素、纖維素等營養(yǎng)需求,強壯紅托竹蓀菌絲,可根據(jù)培養(yǎng)菌絲過程中形成的透明圈大小判定菌種胞外酶產(chǎn)生能力,達到快速評價菌種質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌種由紅托竹蓀(Dictyophorarubrovolvata)竹蛋組織分離獲得,竹蛋采自遼寧蘑磨達食用菌科技有限公司工廠化栽培基地。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮) 200.0 g,放入蒸餾水1 000 mL煮沸20 min,過濾,取濾液,蒸餾水補足1 000 mL,加入葡萄糖 20.0 g,瓊脂 18.0 g,pH值自然;快速分離培養(yǎng)基：取大小為(0.3～0.5) cm ×(0.3～0.5) cm的1 kg木屑加入10 L蒸餾水,煮沸30 min,過濾得木屑水,將200 g土豆切片置于木屑水中,煮沸20～30 min,取濾液用蒸餾水按照實驗要求補足用量;按試驗設(shè)計,稱取不同量的葡萄糖、全麥粉、玉米粉添加入培養(yǎng)基中,文火將18%瓊脂粉融化后裝入500 mL三角瓶中,裝量為300 mL/瓶,121 ℃滅菌20 min,冷卻至35 ℃,分裝一次性培養(yǎng)皿(直徑9 cm),冷卻備用。菌種木屑培養(yǎng)料：將制備木屑水后收集的木屑按照粗木屑70%、細木屑15%、玉米粉10%、全麥粉5%配比(質(zhì)量分數(shù)),含水量60%～65%配制紅托竹蓀木屑菌種培養(yǎng)料,將培養(yǎng)料裝入500 mL玻璃菌種瓶中,裝料至瓶口2～3 cm,用帶有透氣口的塑料瓶蓋封口,121 ℃滅菌120 min,冷卻后備用。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 葡萄糖(分析純,沈陽新興試劑廠);瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司);木屑、全麥粉、玉米粉等購自遼寧蘑蘑達食用菌科技有限公司。生物安全柜(HFsafe1200,上海力申科學儀器有限公司);顯微鏡(Nikon EcLIPSE Ci,上海通灝光電科技有限公司);自動菌落計數(shù)分析儀(Shineso,杭州迅數(shù)科技有限公司);冰箱(BCD-649WADV,青島海爾股份有限公司);立式高壓蒸汽滅菌器(LDZX-75KBS,上海申安醫(yī)療器械廠);電熱鼓風干燥箱(DHG-9240A,上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 紅托竹蓀菌種分離 無菌條件下,用滅菌器具取(0.4～0.6) cm×(0.4～0.6) cm竹蛋內(nèi)白色組織接種至紅托竹蓀菌種木屑培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)30 d,取木屑菌種做為紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基配方優(yōu)化菌種[12-13]。

1.2.2 紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基優(yōu)化 選擇葡萄糖(A)、全麥粉(B)、玉米粉(C)、木屑水(D)4個因素進行考察,每個因素取上限(+1)、下限(-1)2個水平,試驗因素與水平設(shè)計見表1。以紅托竹蓀菌種菌絲生長速度為響應值,通過Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計四因素三水平顯著影響因素的Box-Behnken響應面試驗[16-19],測定菌絲生長速度,對紅托竹蓀菌絲生長速度(mm/d)進行二次多元回歸方程擬合,得到各因素與響應值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程,根據(jù)生成響應面圖確定最優(yōu)的培養(yǎng)基配方(表2)。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

表2 Box-Benhnken 實驗設(shè)計及結(jié)果

1.2.3 快速分離培養(yǎng)基驗證試驗 將按照Design-Expert 8.0.6響應面優(yōu)化的紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基對比并進行木屑培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗,驗證該方程擬合度。①快速分離培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基對比試驗：取1.2.1中紅托竹蓀木屑菌種塊(0.3×0.3) cm ～ (0.5×0.5) cm,接種于PDA培養(yǎng)基、菌種快速分離優(yōu)化培養(yǎng)基中,每皿培養(yǎng)基接種3個木屑菌種塊,3個接種點呈等邊三角形,接種點距離培養(yǎng)皿邊緣0.8～1.0 cm,每種培養(yǎng)基3次重復,25 ℃恒溫培養(yǎng)36

d[20],利用Shineso MF5&MF6數(shù)據(jù)分析平臺,采用十字交叉方法測定菌落直徑,按照菌絲生長速率(mm/d)=菌落平均直徑(mm)/培養(yǎng)時間(d),計算不同培養(yǎng)基菌絲生長速度;在Nikon EcLIPSE Ci 顯微鏡20倍目鏡40倍物鏡條件下,利用NIS-Elements D數(shù)據(jù)平臺觀察菌絲狀態(tài)及鎖狀聯(lián)合,并用測微尺測定菌絲直徑;在Shineso自動菌落計數(shù)分析儀白色底光下,觀察菌落形態(tài)。②木屑培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗：取1.2.3①中同一個培養(yǎng)皿3個接種點接種到同一瓶木屑培養(yǎng)基中,利用劃線法測定PDA培養(yǎng)基、快速分離培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲在木屑培養(yǎng)基25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d的生長速度。木屑培養(yǎng)基菌絲生長速度(mm/d)=菌絲長度(mm)/培養(yǎng)時間(d)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 模型建立及顯著性分析 以紅托竹蓀菌絲生長的菌落直徑為響應值,運用Box-Benhnken設(shè)計29 組試驗。Box-Benhnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的結(jié)果進行多元回歸擬合,得到回歸方程：Y=24.56+0.64A+0.82B+0.34C+0.90D+0.30AB+0.55AC-0.088AD-0.42BC+0.38BD-0.13CD-1.07A2-1.26B2-1.48C2-0.79D2。

該模型的決定系數(shù)R2=0.970 2,校正決定系數(shù) AdjR2=0.940 3,說明實際值和預測值擬合度比較好。由表3可以看出,該回歸模型P<0.000 1,表明此二次模型極顯著,失擬項的P=0.383 1>0.05,模型失擬項不顯著,說明無失擬因素存在,表明該模型在統(tǒng)計學上有意義。模型中 A、B、D、A2、B2、C2、D2的P<0.01,表明這些項對紅托竹蓀菌絲生長速度影響極顯著。C的P<0.05,表明對紅托竹蓀菌絲生長速度的影響顯著。

表3 Box-Benhnken 試驗方差分析

從對紅托竹蓀菌絲生長速度影響分析看,一次項A、B、D均達到極顯著水平,C達到顯著水平影響,影響順序為D(木屑水)>B(全麥粉)>A(葡萄糖)>C(玉米粉)。最后得到的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖20.71 g/L,全麥粉8.36 g/L,玉米粉8.07 g/L,瓊脂粉18.00 g/L,木屑水1.06 L,預見25 ℃恒溫培養(yǎng),最大生長速度為0.62 mm/d。

2.1.2 響應面交互作用分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件,得到兩因素交互作用的3D響應面曲線(圖1)?？梢钥闯鰞梢蛩刂g的交互作用時,其中一個因素固定,隨著另一個因素的增加,紅托竹蓀菌絲生長速度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。曲面傾斜度越大,越接近曲面頂端顏色愈深,表示作用越明顯,說明相關(guān)兩因素交互作用顯著,曲面的變化相對平緩,說明相關(guān)兩因素交互作用不明顯。

圖1 快速分離培養(yǎng)基條件下的 3D 響應面圖Fig.1 3D response surface curve under optimal fermentationconditionsA：A～B因素交互響應曲面;B：A～C因素交互響應曲面;C： A～D因素交互響應曲面;D：B～C因素交互響應曲面;E：B～D因素交互響應曲面;F： C～D因素交互響應曲面A：Response surface stereogram for factors of A and B; B：Response surface stereogram for factors of A and C;C：Response surface stereogram for factors of A and D; D：Response surface stereogram for factors of B and C;E：Response surface stereogram for factors of B and D; F：Response surface stereogram for factors of C and D

2.2 快速分離培養(yǎng)基驗證試驗

2.2.1 PDA培養(yǎng)基、快速分離培養(yǎng)基鎖狀聯(lián)合觀察及菌絲狀態(tài)(菌絲直徑)測定 在Nikon EcLIPSE Ci 顯微鏡20倍目鏡40倍物鏡條件下，利用NIS-Elements D數(shù)據(jù)平臺觀察菌絲狀態(tài)及鎖狀聯(lián)合，并用測微尺測定菌絲直徑(圖2、圖3和表4)。圖2和圖3中“O”標記分別為顯微觀察菌絲鎖狀聯(lián)合和菌絲直徑測定結(jié)果。兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲均可形成鎖狀聯(lián)合；通過測微尺測定菌絲直徑，快速分離培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲直徑均大于PDA固體培養(yǎng)基，菌絲平均直徑增加66.25%。

圖2 PDA培養(yǎng)基與快速分離培養(yǎng)基鎖狀聯(lián)合顯微觀察結(jié)果Fig.2 Combined microscopic observation of PDA medium and rapid culture separation mediumA：PDA培養(yǎng)基; B：菌種快速分離培養(yǎng)基A：PDA medium; B：Rapid culture separation medium

圖3 PDA培養(yǎng)基與菌種快速分離培養(yǎng)基顯微菌絲狀態(tài)對比圖

表4 PDA培養(yǎng)基與快速分離培養(yǎng)基的菌絲直徑顯微測定

2.2.2 PDA培養(yǎng)基、快速分離培養(yǎng)基菌絲生長速度測定 利用Shineso MF5&MF6數(shù)據(jù)分析平臺,采用十字交叉方法測定菌落直徑,按照菌絲生長速率=菌落平均直徑(mm)/培養(yǎng)時間(d),25 ℃恒溫培養(yǎng)36 d[20],計算不同培養(yǎng)基菌絲生長速度(表5)。根據(jù)菌絲生長速率=菌落平均直徑(mm)/培養(yǎng)時間(d)計算PDA培養(yǎng)基與菌種快速分離培養(yǎng)基菌絲生長速度,PDA培養(yǎng)基0.45 mm/d,快速分離培養(yǎng)基0.6 mm/d,快速分離培養(yǎng)基菌絲生長速率提高33.33%。

表5 PDA培養(yǎng)基與菌種快速分離培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)生長速度

2.2.3 PDA培養(yǎng)基、快速分離培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落形態(tài)觀察結(jié)果 在Shineso自動菌落計數(shù)分析儀白色底光下,觀察菌落形態(tài)(圖4),PDA培養(yǎng)基無透明圈形成,而快速分離培養(yǎng)基可以形成透明圈。

圖4 PDA培養(yǎng)基與菌種快速分離培養(yǎng)基菌落形態(tài)(A)及透明圈(B)觀察Fig.4 Observation of colony transparent circle in PDA medium and rapid isolation medium

2.2.4 木屑培養(yǎng)基菌絲生長速度測定結(jié)果 利用劃線法測定PDA培養(yǎng)基、快速分離培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲在木屑培養(yǎng)基中25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d的生長速度,分別為1.47 mm/d和2.12 mm/d(表6),快速分離培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲在木屑培養(yǎng)基中生長速度相比PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲生長速度平均提高44.22%。

表6 兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲在木屑培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的生長速度Table 6 The growth rate of mycelia of 2 medium cultured in wood chips medium for 10 days

3 討 論

食用菌菌絲生長不僅取決于菌種本身特性,還需要合適的培養(yǎng)條件,適合的培養(yǎng)基是提高菌種選育效率,提高菌種質(zhì)量的基礎(chǔ)[21]。紅托竹蓀與其他食用菌種類相比,生長較慢,生長周期長,原因可能是因為菌絲轉(zhuǎn)接后,需要一定時間適應新的生長環(huán)境,即生長恢復期;適應新的環(huán)境后,營養(yǎng)物質(zhì)豐富,菌絲快速生長,即生長旺盛期;待旺盛期后,營養(yǎng)物質(zhì)減少,代謝產(chǎn)物的積累等導致菌絲活力減弱、生長速度逐漸下降[22]。

紅托竹蓀是木腐食用真菌,通過分解木質(zhì)素等為自身的生長提供碳源、氮源[23]。為滿足菌絲生長過程所需營養(yǎng)物質(zhì),使分離純化菌絲快速適應生長環(huán)境,本研究將PDA固體培養(yǎng)基配制用水改為木屑水,同時在培養(yǎng)基內(nèi)添加合適比例的全麥粉和玉米粉[24-25],培養(yǎng)基中含有的淀粉、纖維素、木質(zhì)素等成分,在紅托竹蓀菌種生長過程中可刺激菌種分泌淀粉酶、纖維素酶、木質(zhì)素酶等胞外酶,以維持胞外淀粉酶系、木質(zhì)素酶系、纖維素酶系完整性[26-28],促進菌絲體旺盛生長,提高分離效率。本研究以菌絲生長速度、菌絲直徑等為主要評價指標,通過響應面優(yōu)化確定快速分離培養(yǎng)基最佳配方為葡萄糖20.71 g/L、全麥粉8.36 g/L、玉米粉8.07 g/L、瓊脂粉18.00 g/L、木屑水1.06 L。優(yōu)化的快速分離培養(yǎng)基菌絲直徑平均增加66.25%,平皿培養(yǎng)菌絲日平均生長速度增加33.33%。將優(yōu)化的快速分離培養(yǎng)基培養(yǎng)的紅托竹蓀菌種和PDA培養(yǎng)的紅托竹蓀菌種分別轉(zhuǎn)接至相同配方的木屑培養(yǎng)基中,菌絲在木屑培養(yǎng)基中的生長速度明顯提高,日平均生長速度增加44.22%,縮短了菌種生產(chǎn)周期,為提高紅托竹蓀菌種分離篩選效率奠定基礎(chǔ)。另外,由于在培養(yǎng)基中形成透明圈[29-31],可根據(jù)透明圈大小判定菌種胞外酶產(chǎn)生能力,達到快速評價菌種質(zhì)量,保障菌種質(zhì)量的目的。