陳 嵐, 李玥珂, 任 陽, 黃 榮, 馮亞嵐, 袁 磊, 楊 健

(川北醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院, 四川 南充 637000)

寨卡病毒(Zika Virus, ZIKV)屬黃病毒科黃病毒屬,單正鏈RNA病毒,基因組全長約11.0 kb,兩側(cè)是5′和3′非編碼區(qū),中間包含一個開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF),編碼一個多聚蛋白,該蛋白在翻譯后被水解加工成三種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、前膜蛋白prM和包膜蛋白E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[1]。與其他黃病毒一樣,結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒組裝、黏附和侵入細胞[2],其中E蛋白是介導(dǎo)黃病毒感染入侵的重要蛋白,也是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要抗原[3]。ZIKV于1947年首次在烏干達寨卡森林恒河猴血清中分離獲得[4],自發(fā)現(xiàn)后約半個世紀一直零星感染,近幾年開始在全球爆發(fā)流行引起人們注意。研究證實ZIKV感染是先天性寨卡綜合癥(Congenital Zika syndrome,CZS)和成人格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome, GBS)的病因[5-6]。針對ZIKV感染,目前仍無批準上市的疫苗,有效疫苗的研發(fā)迫在眉睫。ZIKV分為非洲型和亞洲型兩個譜系,近年來亞洲型在世界上引起廣泛流行[7]。毒株MR766與PRVABC59分別為非洲型和亞洲型的代表[8]。非洲株MR766為1947年在烏干達分離出的毒株[4],而亞洲株P(guān)RVABC59為2015年在波多黎各分離出的毒株。研究證實,非洲株比引起廣泛流行的亞洲株具有更強的神經(jīng)毒力[9-10]。有研究指出,亞洲株與非洲株的毒力差異主要由結(jié)構(gòu)蛋白的差異引起[11]。川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院蟲媒病毒研究課題組(本課題組)前期以乙腦疫苗株SA14-14-2為骨架,將其結(jié)構(gòu)蛋白prM/E替換為寨卡病毒的相應(yīng)片段,分別構(gòu)建了嵌合病毒JE/ZIKV(MR766)[12]和JE/ZIKV(PRVABC59)[13]。嵌合病毒JE/ZIKV(MR766)與JE/ZIKV(PRVABC59)對小鼠的腦內(nèi)神經(jīng)毒力LD50分別為22.12 pfu/0.03 mL和>1.0×105pfu/0.03 mL,差異極顯著。通過序列對比分析,發(fā)現(xiàn)二者在E蛋白上有多個氨基酸差異,其中包括E341和E343。E蛋白是黃病毒的主要表面蛋白,在病毒吸附、融合、侵入以及細胞嗜性方面起重要作用[14],結(jié)合序列分析,預(yù)測主要是E蛋白上的氨基酸差異導(dǎo)致了兩嵌合病毒的毒力差異。本研究分別構(gòu)建突變病毒JE/ZIKV(V343A)和JE/ZIKV(I341V/V343A),并比較突變病毒與親本株的神經(jīng)毒力差異,探索E蛋白341和343位氨基酸突變對嵌合病毒神經(jīng)毒力的影響,為進一步研究嵌合病毒減毒機制提供重要依據(jù),也為嵌合病毒疫苗的研發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、病毒、細胞及實驗動物 質(zhì)粒pA-JEV-3′(含乙腦疫苗株SA14-14-2基因nt 3 445～10 970),質(zhì)粒pA-JEV-5′(含乙腦疫苗株SA14-14-2基因nt 1～3 450),質(zhì)粒pA-JE/ZIKV(MR766)-5′(含JE/ZIKV(MR766)基因nt 1～3 450)均為代謝病藥物與生物制品南充市重點實驗室構(gòu)建保存;JE/ZIKV(MR766)嵌合病毒、乙腦疫苗株SA14-14-2、BHK21細胞由代謝病藥物與生物制品南充市重點實驗室提供;清潔級昆明鼠由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 高保真Taq酶、連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自O(shè)MEGA公司;內(nèi)切酶購自NEB公司;體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司;RNA回收試劑盒、質(zhì)粒大量抽提試劑盒均購自QIAGEN公司;抗JEV-E蛋白抗體購自Abcam公司,抗JEV-NS1蛋白抗體、抗ZIKV-E蛋白抗體購自GeneTex公司,Alexa Fluor488標記抗IgG抗體購自上海碧云天生物公司;引物根據(jù)GenBank公布的ZIKV序列(序列號：AY632535.20)設(shè)計,具體序列及用途見表1;引物合成及病毒測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR儀(Mastercycler?nexus,Eppendrof);電泳儀(PowerPacTMUniversal Power Supply,BIO-RAD);電轉(zhuǎn)儀(Gene Pulser XcellTM,BIO-RAD);倒置熒光顯微鏡(DMI4000B,Leica)。

表1 PCR及測序引物

1.2 方法

1.2.1 點突變片段獲取 利用重疊延伸PCR[15-16]以pA-JE/ZIKV(MR766)-5′質(zhì)粒為模板擴增含突變片段prM/E。prM/E(V343A)片段擴增所用兩對引物分別為F2/V343A R和V343A F/R3,prM/E(I341V/V343A)擴增所用引物為F2/(I341V/V343A R)和(I341V/V343A F)/R3。

1.2.2 突變病毒全長cDNA質(zhì)粒構(gòu)建 利用質(zhì)粒pA-JEV-5′和pA-JEV-3′構(gòu)建全長cDNA質(zhì)粒[15-16]。首先用片段prM/E(V343A)和prM/E(I341V/V343A)分別替換pA-JEV-5′上相應(yīng)片段,獲得pA-JE/ZIKV(V343A)-5′和pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′,然后再將5′端質(zhì)粒和pA-JEV-3′質(zhì)粒相連接得到pA-JE/ZIKV(V343A)和pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)全長質(zhì)粒。

1.2.3 突變病毒拯救及傳代 用XhoⅠ線性化全長質(zhì)粒后體外轉(zhuǎn)錄獲取病毒RNA。將RNA電轉(zhuǎn)染入BHK21細胞中,細胞貼壁后更換為含2%(體積分數(shù),下同)血清的培養(yǎng)液,細胞死亡約40%時,凍融收毒,2 000 r/min離心10 min后,將上清分裝-80 ℃保存,為P1代病毒。在T25培養(yǎng)瓶中接種BHK21細胞,待融合度達80%時,按M.O.I.=0.01接種病毒,37 ℃, 5% CO2吸附1 h,期間每隔20 min混勻1次,1 h后更換為2%維持液,細胞出現(xiàn)40%死亡時收毒,即為P2代病毒,以同樣方法傳至病毒滴度滿足實驗要求為止。

1.2.4 病毒測序 提取病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用測序引物擴增后,膠回收目的片段送檢測序。

1.2.5 免疫熒光 將BHK21細胞接種于96孔板,24 h后,以M.O.I.=0.01將SA-14-14-2、JE/ZIKV(V343A)、JE/ZIKV(I341V/V343A)分別接種于96孔板,同時設(shè)置不接種病毒液的空白對照孔。48 h后棄原培養(yǎng)液,1×PBS洗滌后,4%多聚甲醛固定30 min,0.5% TritonX-100透膜10 min,在對應(yīng)孔加入抗JEV-E抗體(1∶20稀釋)、抗JEV-NS1抗體(1∶1 000稀釋)、抗ZIKV-E抗體(1∶500稀釋)各30 μL,37 ℃孵育1 h后,1×PBS充分洗滌,加入Alexa Fluor488標記二抗(1∶500稀釋,50 μL/孔),37 ℃孵育1 h,1×PBS充分洗滌,DAPI染色3 min,1×PBS洗滌,熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.6 蝕斑實驗 將BHK21細胞接至6孔板中,融合度達70%時,按10的倍數(shù)梯度稀釋病毒,每孔加入400 μL稀釋后的病毒液,37 ℃吸附1 h后,更換為含1%低熔點瓊脂糖,2%血清的覆蓋物,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4～5 d后,4%甲醛固定,10 g/L的結(jié)晶紫染色,計數(shù)空斑數(shù)以推算病毒滴度,并測定蝕斑直徑,觀察蝕斑特點。

1.2.7 生長曲線 接種BHK21細胞至培養(yǎng)皿,融合度達80%時,以M.O.I.=0.01,分別用JE/ZIKV(MR766)、JE/ZIKV(V343A)、JE/ZIKV(I341V/V343A)感染細胞,每隔12 h收集上清直到細胞全部死亡。將收集的上清做蝕斑實驗,測定病毒滴度并繪制病毒生長曲線,對比突變病毒與親本株增殖特性差異。

1.2.8 突變病毒神經(jīng)毒力測定 將JE/ZIKV(MR766)、JE/ZIKV(V343A)、JE/ZIKV(I341V/V343A)以10為梯度作倍比稀釋,以0.03 mL/只的劑量顱內(nèi)接種3周齡昆明鼠,連續(xù)觀察14 d,記錄各組動物死亡情況并計算LD50,對比突變病毒與親本株神經(jīng)毒力差異。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用spss23.0處理數(shù)據(jù),得到各毒株蝕斑直徑平均值 標準差(SD)。使用t檢驗,分析兩突變病毒蝕斑直徑與親本株差異,當P<0.05時,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 點突變片段獲取

以pA-JE/ZIKV(MR766)-5′為模板,引物F2/V343A R擴增得到大小約1.5 kb片段1,V343A F/R3擴增得到大小約0.7 kb片段2,重疊延伸后用引物F2/R3擴增得到大小約2.2 kb產(chǎn)物prM/E(V343A),與理論相符(圖1A)。prM/E(I341V/V343A)擴增過程中各產(chǎn)物大小與prM/E(V343A)相近(圖2A)。

圖1 pA-JE/ZIKV(V343A)全長質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pA-JE/ZIKV(V343A) full-length plasmidA：含V343A突變PCR擴增產(chǎn)物;B：pA-JE/ZIKV(V343A)-5′酶切鑒定;C：pA-JE/ZIKV(V343A)全長酶切鑒定。M1：DNA分子量標(DL2 000);M2：DNA分子量標(DL15 000);1：含V343A突變片段2;2：含V343A突變片段1;3：含V343A突變prM/E片段;4：pA-JE/ZIKV(V343A)-5′;5：pA-JE/ZIKV(V343A)-5′KasⅠ+BglⅡ;6：pA-JE/ZIKV(V343A)-5′/BglⅡ+BspEⅠ;7：pA-JE/ZIKV(V343A)-5′/XhoⅠ;8：pA-JE/ZIKV(V343A);9：pA-JE/ZIKV(V343A)/BglⅡ;10：pA-JE/ZIKV(V343A)/XhoⅠ+BspEⅠ;11：pA-JE/ZIKV(V343A)/AscⅠ+XhoⅠA： PCR amplification product containing V343A mutation; B： Restriction endonuclease analysis of pA-JE/ZIKV(V343A)-5′; C： Restriction endonuclease analysis of pA-JE/ZIKV(V343A). M1： DNA marker(DL2 000); M2： DNA marker(DL15 000); 1： Fragment 2 containing V343A mutation; 2： Fragment 1 containing V343A mutation; 3： Fragment prM/E containing V343A mutation; 4： pA-JE/ZIKV(V343A)-5′; 5： pA-JE/ZIKV(V343A)-5′/KasⅠ+BglⅡ; 6： pA-JE/ZIKV(V343A)-5′/BglⅡ+BspEⅠ;7： pA-JE/ZIKV(V343A)-5′/XhoⅠ; 8： pA-JE/ZIKV(V343A); 9： pA-JE/ZIKV(V343A)/BglⅡ; 10： pA-JE/ZIKV(V343A)/XhoⅠ+ BspEⅠ;11： pA-JE/ZIKV(V343A)/AscⅠ+Xho Ⅰ

圖2 pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)全長質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定Fig.2 Construction and identification of pA-JE/ZIKV(I341V/V343A) full-length plasmidA：含I341V/V343A突變PCR擴增產(chǎn)物;B：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′酶切鑒定;C：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)全長酶切鑒定;M1：DNA分子量標(DL2 000);M2：DNA分子量標(DL15 000);1：含I341V/V343A突變片段2;2：含I341V/V343A突變片段1;3：含I341V/V343A突變prM/E片段;4：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′/Kas Ⅰ+Bgl Ⅱ;5：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′/BglⅡ+BspEⅠ;6：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′/XhoⅠ;7：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′;8：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A);9：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)/BglⅡ;10：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)/Asc Ⅰ+XhoⅠ;11：pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)/XhoⅠ+BspEⅠA： PCR amplification product containing I341V/V343A mutation; B： Restriction endonuclease analysis of pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′; C： Restriction endonuclease analysis of pA-JE/ZIKV(I341V/V343A). M1： DNA marker(DL2 000); M2： DNA marker(DL15 000); 1： Fragment 2 containing I341V/V343A mutation; 2： Fragment 1 containing I341V/V343A mutation; 3： Fragment prM/E containing I341V/V343A mutation; 4： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′/KasⅠ+BglⅡ; 5： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′/Bgl Ⅱ+BspEⅠ; 6： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′/XhoⅠ; 7： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′; 8： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A); 9： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)/Bgl Ⅱ; 10： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)/AscⅠ+XhoⅠ; 11： pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)/XhoⅠ+BspEⅠ

2.2 pA-JE/ZIKV(V343A)-5′及pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′質(zhì)粒酶切鑒定

將得到的pA-JE/ZIKV(V343A)-5′端質(zhì)粒分別用KasⅠ+BglⅡ、BglⅡ+BspEⅠ、XhoⅠ酶切,其中經(jīng)KasⅠ+BglⅡ雙酶切得到約2.2 kb和3.6 kb的片段,經(jīng)BglⅡ+BspE Ⅰ雙酶切得到約0.8 kb和5.0 kb的片段,XhoⅠ單酶切得到線性化片段約5.8 kb,大小與理論相符(圖1B)。pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′端酶切鑒定方式同pA-JE/ZIKV(V343A)-5′,結(jié)果均與理論相符(圖2B)。表明pA-JE/ZIKV(V343A)-5′及pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)-5′質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 pA-JE/ZIKV(V343A)及pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)全長質(zhì)粒酶切鑒定

將得到的pA-JE/ZIKV(V343A)全長質(zhì)粒用XhoⅠ+BspEⅠ、AscⅠ+XhoⅠ、BglⅡ酶切,其中經(jīng)XhoⅠ+BspEⅠ酶切得到大小約6.0 kb和7.5 kb片段,AscⅠ+XhoⅠ雙酶切得到約11.0 kb和2.5 kb片段,BglⅡ單酶切得到大小約為7.0、5.2、1.3 kb共3條片段,大小與理論相符(圖1C)。pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)全長質(zhì)粒鑒定同pA-JE/ZIKV(V343A),酶切片段大小均與理論相符(圖2C)。表明pA-JE/ZIKV(V343A)及pA-JE/ZIKV(I341V/V343A)全長質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 病毒測序

將測序結(jié)果與GenBank發(fā)表的ZIKV(MR766)序列(序列號：AY632535.20)和乙腦病毒疫苗株SA14-14-2序列(序列號：AF315119.1)相比對,顯示突變構(gòu)建成功,除構(gòu)建的突變點以外無其他突變(圖3)。

圖3 JE/ZIKV(V343A)及JE/ZIKV(I341V/V343A)測序Fig.3 Sequencing of JE/ZIKV(V343A) and JE/ZIKV(I341V/V343A)

2.5 免疫熒光

免疫熒光實驗顯示,以乙腦疫苗株SA14-14-2為骨架的嵌合病毒能夠被抗JEV-NS1抗體和抗ZIKV-E抗體識別,不能被抗JEV-E抗體識別,而對照組JEV SA14-14-2能夠被抗JEV-NS1抗體和抗JEV-E抗體識別,不能被抗ZIKV-E抗體識別(圖4)。表明病毒能夠表達JEV-NS1蛋白和ZIKV-E蛋白,嵌合病毒拯救成功。

圖4 間接免疫熒光鑒定Fig.4 Identification of E protein under fluorescence microscopy

2.6 蝕斑實驗

JE/ZIKV(V343A)、JE/ZIKV(I341V/V343A)蝕斑直徑分別為(1.09± 0.15) mm和(1.15± 0.29) mm,小于JE/ZIKV(MR766)(2.09± 0.36) mm,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均小于0.001),而JE/ZIKV(V343A)與JE/ZIKV(I341V/V343A)間蝕斑直徑大小無差異(P>0.05),見圖5。表明V343A突變及I341V/V343A聯(lián)合突變后嵌合病毒蝕斑減小。

圖5 病毒蝕斑比較Fig.5 Comparison of virus plaques

2.7 生長曲線

生長曲線顯示,JE/ZIKV(I341V/V343A)滴度于60 h達到高峰(6.853 Log10pfu/mL),JE/ZIKV(V343A)稍慢,于72 h達峰值(5.889 Log10pfu/mL),隨后滴度開始緩慢下降,而JE/ZIKV(MR766)在96 h仍未達到峰值。整個過程中JE/ZIKV(MR766)的滴度均低于兩突變病毒,JE/ZIKV(V343A)滴度低于JE/ZIKV(I341V/V343A)(圖6)。表明V343A突變及I341V/V343A聯(lián)合突變后嵌合病毒增殖增快。

圖6 病毒生長曲線Fig.6 Growth curve of the viruses

2.8 突變病毒小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力測定

感染親本株與突變病毒小鼠均出現(xiàn)精神萎靡、僵直、后肢癱瘓等神經(jīng)病變癥狀,小鼠生存情況見圖7。用Reed-Muench法計算得JE/ZIKV(MR766) LD50為2.21 pfu/0.03 mL,JE/ZIKV(V343A) LD50為5.62 pfu/0.03 mL,JE/ZIKV(I341V/V343A) LD50為34.84 pfu/0.03 mL(表2)。表2表明,V343A突變及I341V/V343A聯(lián)合突變后嵌合病毒毒力減弱。

圖7 嵌合病毒感染后小鼠生存曲線Fig.7 Survival curve of mice infected with chimeric viruses

表2 突變病毒小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力

3 討 論

嵌合病毒疫苗是減毒疫苗的一種類型。由于黃病毒具有相同的基因結(jié)構(gòu),使得利用已有減毒疫苗株為骨架來構(gòu)建嵌合病毒疫苗成為可能。嵌合病毒疫苗既有疫苗株的減毒復(fù)制機制,同時也表達目標病毒的主要結(jié)構(gòu)抗原。利用不同骨架構(gòu)建的ZIKV嵌合病毒已有較多報道,例如以YFV-17D為骨架構(gòu)建的寨卡病毒嵌合株Chimeri Vax-Zika (CYZ)、YF-ZIKprM/E、CH-17-D/ZIKV[17-19]等,以DENV-2為骨架構(gòu)建的嵌合病毒疫苗候選株DENV-2/ZIKV[20]。Li等[21]利用SA14-14-2為骨架構(gòu)建的嵌合病毒chin-ZIKV在多種動物模型中表現(xiàn)出減毒及較好的免疫保護作用,表明了嵌合病毒疫苗是一種安全且有效的ZIKV病毒疫苗研發(fā)方式。

E蛋白參與病毒黏附、侵入細胞和誘導(dǎo)宿主中和抗體產(chǎn)生等[14],是黃病毒的重要疫苗研發(fā)靶點之一。E蛋白分為三個結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)Ⅰ(EDⅠ)、結(jié)構(gòu)域Ⅱ(EDⅡ)、結(jié)構(gòu)域Ⅲ(EDⅢ)。EDⅢ在病毒識別細胞受體和介導(dǎo)膜融合中發(fā)揮重要作用,該區(qū)域中的氨基酸突變會影響病毒的毒力和細胞嗜性[22]。相對于非嗜神經(jīng)性黃病毒,ZIKV和其他嗜神經(jīng)性黃病毒EDⅢ中的CD環(huán)結(jié)構(gòu)中多出一位氨基酸,從而使得CD環(huán)進一步擴大,這個結(jié)構(gòu)已被證實可以增強ZIKV的穩(wěn)定性和致病能力[23-26]。此外,在ZIKV包膜結(jié)構(gòu)中,相鄰的CD環(huán)之間又形成氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)[27],進一步增加了病毒的穩(wěn)定性。E341、E343均位于ZIKV的CD環(huán)中,因此猜測這兩個位點極有可能是影響ZIKV神經(jīng)毒力的關(guān)鍵氨基酸位點。

病毒蝕斑實驗表明,突變病毒JE/ZIKV(V343A)(1.09±0.15) mm、JE/ZIKV(I341V/V343A)(1.15±0.29) mm蝕斑直徑均小于親本株JE/ZIKV(MR766)(2.09±0.36) mm(P<0.001),而在減毒活疫苗的研發(fā)中,通常以蝕斑直徑減小作為毒力減弱的標志[28-29],突變病毒蝕斑直徑減小提示病毒毒力減弱。動物實驗結(jié)果顯示,突變病毒JE/ZIKV(V343A)(LD50=5.62 pfu/0.03 mL)、JE/ZIKV(I341V/V343A)(LD50=34.84 pfu/0.03 mL)神經(jīng)毒力弱于親本株JE/ZIKV(MR766)(LD50=2.21 pfu/0.03 mL),與蝕斑結(jié)果一致。生長曲線結(jié)果顯示,突變病毒增殖速度較親本株增快,聯(lián)合突變病毒JE/ZIKV(I341V/V343A)略快于JE/ZIKV(V343A)。有文獻報道,減弱宿主細胞凋亡效應(yīng)能夠促進病毒復(fù)制[30-31]。本研究中,突變病毒神經(jīng)毒力較親本株弱,但增殖卻更快,可能是突變病毒誘導(dǎo)細胞凋亡減弱導(dǎo)致。

Xie等[32]研究發(fā)現(xiàn),通過構(gòu)建ZIKV包膜蛋白T351V突變破壞CD環(huán)間的氫鍵相互作用后,病毒毒力明顯減弱,而通過構(gòu)建突變ΔE346氨基酸縮小CD環(huán)結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致病毒無法組裝。同樣,Gallichotte等[24]研究也證實ZIKV擴展CD環(huán)在細胞類型依賴性復(fù)制、病毒粒子穩(wěn)定性和體內(nèi)發(fā)病機制起關(guān)鍵作用。結(jié)合文獻推測有可能是V343A、I341V/V343A聯(lián)合突變影響了CD環(huán)結(jié)構(gòu)使病毒神經(jīng)毒力減弱,或者是通過破壞CD環(huán)的穩(wěn)定性,進一步破壞了CD環(huán)E350及E351處氫鍵網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性而使病毒毒力減弱。但由于本課題組在多次重復(fù)都未能得到I341V單點突變病毒,原因有待深入分析,因此未能對I341V單點突變病毒進行相關(guān)研究。綜上所述,本研究結(jié)果表明,V343A、I341V/V343A突變均能夠使嵌合病毒JE/ZIKV(MR766)毒力減弱,且I341V/V343A聯(lián)合突變毒力較V343A單位點突變?nèi)?減毒程度呈現(xiàn)出累加效應(yīng)。