王世偉, 王卿惠

(1．齊齊哈爾大學(xué)生命與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 齊齊哈爾 161005; 2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)屬于芽胞桿菌屬(Bacillus),能抗植物病原菌,促進(jìn)植物生長(zhǎng),在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、果蔬采后病害防治方面應(yīng)用前景廣泛[1-6]。解淀粉芽胞桿菌可用于生產(chǎn)生物農(nóng)藥,具有取代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的趨勢(shì),同時(shí)還具有綠色、安全、高效等優(yōu)勢(shì)[7-8]。該菌在自身生長(zhǎng)過程中,能產(chǎn)生抗菌物質(zhì),包括抗菌蛋白、脂肽類和聚酮化合物等,其中抗菌脂肽在植物病害防控上發(fā)揮了重要作用[9-10]?？咕鞍资且活悓?duì)植物病原菌具有抑制作用的活性蛋白,不易產(chǎn)生抗性,對(duì)人體與環(huán)境不會(huì)造成危害[11]。盡管目前解淀粉芽胞桿菌抗菌和促生機(jī)理已有大量研究報(bào)道,但對(duì)該菌的生境多樣性、分子鑒定以及其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)工作仍不能忽視,本文對(duì)目前相關(guān)研究成果進(jìn)行歸納分析,以期為解淀粉芽胞桿菌菌株的應(yīng)用提供參考。

1 解淀粉芽胞桿菌的特點(diǎn)

1.1 解淀粉芽胞桿菌的描述

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為芽胞桿菌屬細(xì)菌,與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis) 具有很高的親緣性,二者的革蘭染色均呈陽(yáng)性,在形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化特性等方面十分相似;解淀粉芽胞菌屬兼性厭氧菌,分布廣,在LB培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色、不透明,不產(chǎn)色素,有隆起,表面粗糙,邊緣不規(guī)則,在液體靜止培養(yǎng)時(shí)能形成菌膜;菌體細(xì)胞呈桿狀,具兩端鈍圓的橢圓形內(nèi)生芽胞,芽胞囊不膨大,中生到次端生,有運(yùn)動(dòng)性。

解淀粉芽胞桿菌許多生理生化試驗(yàn),例如甲基紅(MR)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性,特別是該菌能水解淀粉和明膠[12-13]。

解淀粉芽胞桿菌能承受極端條件,因此其在不同領(lǐng)域包括食品(酶合成、益生元和益生菌以及功能和生物活性食品)、醫(yī)藥(抗微生物、抗癌和抗糖尿病)、農(nóng)業(yè)(植物和動(dòng)物疾病的抑制)、環(huán)境(廢物處理和生物燃料)以及其他加工領(lǐng)域具有重要作用;解淀粉芽胞桿菌能水解不同動(dòng)物和植物產(chǎn)品,合成不同酶、蛋白和碳水化合物,發(fā)揮益生元和益生菌的作用,并能產(chǎn)生酶、抗菌劑、殺蟲劑、生化物質(zhì)、胞外多糖(EPS)、維生素、嘌呤核苷和聚-γ-谷氨酸,其中EPS具有許多功能應(yīng)用包括抗病毒、抗腫瘤、抗癌、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性,其中脂肽(serrawettin、surfactin和viscosin)具有抗微生物、抗病毒、抗炎和抗粘性作用[14]。

1.2 解淀粉芽胞桿菌分離純化、生境多樣性及鑒定策略

解淀粉芽胞桿菌具有豐富的生境多樣性,其分離和鑒定已有許多報(bào)道,分離方法包括初篩和復(fù)篩,可以利用平板對(duì)峙法進(jìn)行菌體初篩,利用雙層平板法進(jìn)行復(fù)篩;其鑒定采用形態(tài)和分子生物學(xué)方法,例如16S rDNA序列分子等。

如表1所示,有些菌株能產(chǎn)生廣譜抗菌物質(zhì),對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌均具抑制作用,但對(duì)不同病原真菌、細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)弱不同。已報(bào)道從各種環(huán)境中,均能分離出解淀粉芽胞桿菌,包括土壤(包括根際土壤)[15-16]、植物(棉籽殼)[17]、動(dòng)物體(鯽魚腸道)[18]、海水[19]等。筆者[20]曾報(bào)道,北大倉(cāng)白酒大曲具有豐富的細(xì)菌多樣性,也存在解淀粉芽胞桿菌。司世飛等[15]從土樣中分離了82種細(xì)菌,具體方法為稱取10 g土樣于裝有90 mL無菌水錐形瓶中,搖床震蕩20 min后,采用稀釋涂布平板法將稀釋至10-6和10-7的菌液涂布NA平板,35 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)36 h后挑選不同形態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)并保存于NA斜面,然后再經(jīng)初篩和復(fù)篩獲得具有不同功能的解淀粉芽胞桿菌。努爾孜亞等[17]將1 g棉籽殼加入100 mL蒸餾水中,制備懸濁液,稀釋至10-6、10-7、10-8(W/V) 的樣品溶液,分別取0.1 mL 涂布于固體初篩培養(yǎng)基平板上,30 ℃培養(yǎng)24 h;然后以對(duì)峙平板法復(fù)篩,從初篩平板上挑取形態(tài)不同的菌落在木霉病菌瓊脂塊的一側(cè)劃線,以不劃線的作為對(duì)照組,培養(yǎng)4 d,測(cè)其抑菌率,獲得細(xì)菌的純化培養(yǎng)物。朱芝秀等[18]取鄱陽(yáng)湖野外生長(zhǎng)健康鯽魚腸道，60 ℃水浴加熱15 min后，取腸道黏膜劃線接種普通瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征，挑取典型菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察菌體顯微形態(tài)特征。挑取經(jīng)革蘭染色后的單個(gè)菌落，劃線接種于普通瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng)；將分離菌按常規(guī)細(xì)菌生化試驗(yàn)方法接種各種微量生化發(fā)酵管，37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后，觀察記錄生化特性；將分離菌接種普通肉湯培養(yǎng)液，37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按瓊脂擴(kuò)散法做藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈大??；將牛津杯輕放于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，其內(nèi)加入分離菌肉湯培養(yǎng)物，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察溶蛋白現(xiàn)象，同時(shí)以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，溶蛋白透明圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制分離菌產(chǎn)蛋白酶曲線圖。筆者從北大倉(cāng)白酒大曲中分離的解淀粉芽胞桿菌M1-1菌株的純培養(yǎng)物的獲得方法與上述方法類似(研究成果待發(fā)表)?？梢娊獾矸垩堪麠U菌在食品、植物、動(dòng)物、土壤及其他環(huán)境中無處不在，具有豐富的生境多樣性，其純化方法大同小異，一般采用稀釋平板法結(jié)合平板對(duì)峙可以進(jìn)行有效的分離純化。

表1 解淀粉芽胞桿菌抗真菌活性物質(zhì)的分離、純化和功能研究

通?？梢砸佬螒B(tài)、生理生化特征及分子手段對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,但采用16S rDNA分子標(biāo)記鑒定菌株方法較為多見。實(shí)際上除了采用16S rDNA分子標(biāo)記外,還可結(jié)合菌株特異性酶基因擴(kuò)增進(jìn)行菌種鑒定,例如Khan等[21]使用16S rRNA基因序列分析并結(jié)合物種特異性的限制性核酸內(nèi)切酶(BamH I)基因和核糖核酸酶基因擴(kuò)增準(zhǔn)確鑒定了解淀粉芽胞桿菌COFCAU_P1。Camacho等[22]從San Pablo河淡水沉積物中分離出一株芽胞桿菌,經(jīng)16S rRNA基因分析確定該分離株A3屬于解淀粉芽胞桿菌操作群,通過gyrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定該菌屬于解淀粉芽胞桿菌亞種植物叢。通常使用核糖體RNA小亞基部分(16S)高通量DNA測(cè)序鑒定解淀粉芽胞桿菌[23],但有時(shí)無法鑒定到亞種水平,而管家基因鑒定解淀粉芽胞桿菌是可行的,如rpoB基因、gyrA基因和gyrB基因等是評(píng)估微生物多樣性的潛在候選基因,比用16S rRNA基因分析方法有更高系統(tǒng)發(fā)育分析的分辨率;通常每個(gè)基因組只有1個(gè)或2個(gè)管家基因拷貝,與高拷貝數(shù)基因相比,使用低拷貝數(shù)基因可以避免因不同基因拷貝中的SNPs而高估多樣性,從而實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果[24];事實(shí)上,一些研究已經(jīng)測(cè)試rpoB基因和gyrB基因作為分子標(biāo)記,通過擴(kuò)增子測(cè)序來分析細(xì)菌群落的多樣性,在某些條件下持家基因測(cè)序比16S rRNA測(cè)序能更準(zhǔn)確[25-26]。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)持家基因gyrA也可以作為確定芽胞桿菌物種多樣性的分子標(biāo)記的潛力,通過引物設(shè)計(jì)能顯著提高芽胞桿菌物種多樣性的擴(kuò)增效率;通過新引物對(duì)gyrA3的設(shè)計(jì),經(jīng)92種芽胞桿菌和相關(guān)物種的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)gyrA基因高變異性允許在亞種水平上對(duì)解淀粉芽胞桿菌、短小芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌進(jìn)行更詳細(xì)聚類,而16S rRNA基因無法實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn),說明gyrA可以提供比16S rRNA基因更好的系統(tǒng)發(fā)育分辨率?？傊?解淀粉芽胞桿菌的生境能使我們深入了解解淀粉芽胞桿菌的生態(tài)。了解如何對(duì)解淀粉芽胞桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是一個(gè)關(guān)鍵的問題,在形態(tài)、生態(tài)和生理生化的基礎(chǔ)上,采用16S rRNA基因分析和管家基因分析的結(jié)合,可提高對(duì)解淀粉芽胞桿菌鑒定的可靠性和準(zhǔn)確性。

2 解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1 解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)基優(yōu)化是提高解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵的重要手段。培養(yǎng)基碳源、氮源的篩選,緩沖液甄別、金屬離子和生長(zhǎng)因子的選用,是培養(yǎng)基優(yōu)化應(yīng)該考慮的重要參數(shù)?？梢圆捎脝我蛩?、雙向單因素、正交試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法等方法優(yōu)化培養(yǎng)基。騰軍偉等[28]從甜酒曲中篩選到產(chǎn)凝乳酶的解淀粉芽胞桿菌GSBa-1,并采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化,凝乳酶活力比優(yōu)化前提高1.88倍。

如表2所示,培養(yǎng)基優(yōu)化可提高解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)孢率、抗菌活性和抗菌物合成能力,要根據(jù)不同目的優(yōu)化選擇不同培養(yǎng)基成分。呂釗等[29]采用Box-Behnken試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)抗菌素發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,使用遲效碳源淀粉作為碳源,顯著提高了該菌的抗菌活性。梁昌聰?shù)萚30]利用Plackett-Burman優(yōu)化C101菌株培養(yǎng)基,篩選出MnSO4、KHPO3和(NH)2SO4為影響產(chǎn)孢的3個(gè)主要因素,再運(yùn)用最陡爬坡路徑法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域,最后利用響應(yīng)面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件,發(fā)現(xiàn)尿素是添加的必須物質(zhì)。楊勝遠(yuǎn)等[31]使用蘭迪培養(yǎng)基優(yōu)化K6菌株培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn),KH2PO4、MgSO4和MnSO4能顯著影響抗菌活性物質(zhì)合成,而KCl不利于抗菌活性物質(zhì)合成;FeSO4和CuSO4幾乎對(duì)抗菌活性物質(zhì)合成沒有影響。楊代凱等[32]優(yōu)化了ZM9液體發(fā)酵產(chǎn)伊枯草菌素A培養(yǎng)基,采用液化玉米淀粉、豆粕為碳源和氮源,顯著提高了伊枯草菌素A產(chǎn)量。解淀粉芽胞桿菌W36還可以對(duì)考馬斯亮藍(lán)、剛果紅和Sarranine等染料進(jìn)行需氧脫色,利用最優(yōu)化的培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌能發(fā)揮最好的脫色效果[33]。

表2 解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

聚乳酸(PLA)是可生物降解塑料,可替代一次性包裝材料和地膜。盡管PLA在浸沒或堆肥條件下的生物降解速度加快,但在土壤埋置條件下提高PLA生物降解能力仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在解淀粉芽胞桿菌中,使用大豆蛋白作為氮源可提高其對(duì)PLA膜的生物降解能力;控制氮源可能是增加聚乳酸生物降解的新途徑[35]?？梢娪袝r(shí)僅僅優(yōu)化培養(yǎng)基中一種物質(zhì),例如氮源,就能使該細(xì)菌某種生物功能得到顯著改善。

通過解淀粉芽胞桿菌C10培養(yǎng)基的優(yōu)化,芽胞產(chǎn)率提高188%。最近有報(bào)道顯示,在芽胞桿菌中,孢子形成過程與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成和釋放有關(guān),例如次級(jí)代謝產(chǎn)物桿菌霉素D(BD)就與解淀粉芽胞桿菌fmbJ的孢子形成相關(guān),研究發(fā)現(xiàn),BD和Mn2+通過刺激kinB、kinD的轉(zhuǎn)錄以及增加spo0F-spo0A磷酸化傳遞的影響,促進(jìn)了fmbJ的孢子形成[36]。

優(yōu)化培養(yǎng)基是提高解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)酶活性的最重要策略之一。Zhao等[37]采用平板透明圈法從動(dòng)物糞便中篩選出蛋白酶產(chǎn)量高的解淀粉芽胞桿菌FMME ZK003。為了實(shí)現(xiàn)蛋白酶的高效生產(chǎn),經(jīng)過菌種改良再進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化,蛋白酶活性提高到(456.9±0.23)U/mL,5 L發(fā)酵罐發(fā)酵解淀粉芽胞桿菌蛋白酶活性達(dá)到823 U/mL。甲喹酮-7能預(yù)防心血管疾病和骨質(zhì)疏松癥。Li等[38]通過改良解淀粉芽胞桿菌和培養(yǎng)基優(yōu)化組合策略提高甲喹酮-7(MK-7)產(chǎn)量。首次通過常壓和室溫等離子體誘變和原生質(zhì)體融合,改變生物合成途徑,構(gòu)建MK-7高產(chǎn)菌株Ba-4。隨后,使用單因素優(yōu)化和響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化培養(yǎng)基組分,提高了菌株Ba-4的MK-7產(chǎn)量;響應(yīng)面法結(jié)果表明,甘油、大豆蛋白胨和吐溫-80對(duì)MK-7的產(chǎn)生有顯著影響,MK-7產(chǎn)量比初始培養(yǎng)基顯著提高。

可見,解淀粉芽胞桿菌是一種益生菌,它有許多特性可供人們利用。因此,在優(yōu)化培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)中,為了達(dá)到不同目的必須選擇合適碳源和氮源,去除對(duì)發(fā)酵不利的或無用的培養(yǎng)基成分,增添對(duì)發(fā)酵有利的成分,使菌株獲得最佳營(yíng)養(yǎng),從而達(dá)到不同的優(yōu)化目的和最佳效果。

2.2 解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)條件優(yōu)化一般包括溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、初始和裝液量,優(yōu)化的目的多種多樣,比如增加菌株脂肽、抗性蛋白和抗菌物質(zhì)等。解淀粉芽胞桿菌脂肽在植物對(duì)真菌、細(xì)菌和病毒的保護(hù)中發(fā)揮著重要作用,表現(xiàn)出殺菌、抗菌、抗病毒和殺蟲能力,以及植物免疫調(diào)節(jié)活性[39]。

如表3所示,王勇等[40]對(duì)解淀粉芽胞桿菌GZ-5進(jìn)行了研究,在發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)用10倍稀釋液、菌懸液原液對(duì)番茄的促生效果最佳。解淀粉芽胞桿菌具有廣泛的抑菌活性,其菌體能產(chǎn)生多種抑菌蛋白[41]。秦楠等[42]對(duì)菌株HRH317抑菌蛋白生產(chǎn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)37 ℃適合抑菌蛋白表達(dá),發(fā)酵時(shí)間控制在對(duì)數(shù)期比較合適,轉(zhuǎn)速略高較好。裘紀(jì)瑩等[43]對(duì)解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外抗菌物質(zhì)進(jìn)行了研究,以該菌株發(fā)酵液對(duì)西瓜枯萎病菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑為指標(biāo),經(jīng)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)及Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化,確定了其最佳發(fā)酵條件,優(yōu)化后顯著提高了發(fā)酵液抑菌活性。牛奶凝固酶(MCE)是奶酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵成分,由于傳統(tǒng)凝固酶的局限性,尋找可行的替代品是一個(gè)緊迫的問題[44]。解淀粉芽胞桿菌D4凝固酶的培養(yǎng)時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速是優(yōu)化培養(yǎng)的關(guān)鍵[45]。從上面的研究可以看出,抑菌蛋白和其他抗菌物質(zhì)生產(chǎn)時(shí),所需溫度應(yīng)更符合細(xì)菌正常生長(zhǎng)溫度,而其他抑菌物生產(chǎn)要求較低溫度;同樣,抑菌蛋白形成在對(duì)數(shù)早期,而其他抗菌物質(zhì)多在發(fā)酵穩(wěn)定期和后期,這可能是其他抗菌物多為細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物,因而多在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期或衰亡期,即發(fā)酵后期產(chǎn)生。可見,不同解淀粉芽胞桿菌對(duì)培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件要求不同,但是總體來說維持在一定的范圍內(nèi),不同的培養(yǎng)基,其培養(yǎng)溫度一般為25～37 ℃,pH為偏中性,搖床轉(zhuǎn)速140～241 r/min;培養(yǎng)時(shí)間24～60 h為宜。蛋白酶作為一種重要的工業(yè)酶,一般從微生物中獲得的蛋白酶活性并不高,難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)。Zhao等[46]采用平板透明圈法從動(dòng)物糞便中篩選出蛋白酶產(chǎn)量高的解淀粉芽胞桿菌,通過常壓室溫等離子體(ARTP)、60Co-γ輻射進(jìn)行聯(lián)合誘變,菌株FMME ZK003蛋白酶活性大幅度提高,優(yōu)化發(fā)酵條件后,蛋白酶活性顯著提高;最后,5 L發(fā)酵罐發(fā)酵使蛋白酶活性達(dá)到823 U/mL?？梢?了解優(yōu)化數(shù)據(jù),可能找出一定的規(guī)律,按相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化,可能達(dá)到最佳的效果。

表3 解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3 解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的同時(shí)優(yōu)化

對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同時(shí)優(yōu)化的目的是為了提高解淀粉芽胞桿菌活菌數(shù),增強(qiáng)抑制病原菌活性,提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量,提高菌種產(chǎn)酶活性,增加胞外多糖產(chǎn)量以及凈化水質(zhì)等,可采用單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

如表4所示,在優(yōu)化解淀粉芽胞桿菌T1發(fā)酵條件之前,從五種培養(yǎng)基中選出最有利于其生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基,加入復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液和蜜糖作為培養(yǎng)基的必要成分[47],不同菌株最佳發(fā)酵參數(shù)不同。FS6菌株能抑制人參立枯絲核菌,需添加酵母浸膏和甘油作為最優(yōu)培養(yǎng)基的必要成分,培養(yǎng)12 h,相對(duì)培養(yǎng)時(shí)間較短[48]。12-7菌株對(duì)棉花黃萎病菌大麗輪枝菌具有明顯拮抗作用,經(jīng)優(yōu)化其抗菌蛋白抑菌活性明顯提高[49]。GZUB-7菌株可產(chǎn)中性蛋白酶,優(yōu)化后中性蛋白酶活力明顯提升[50]?？梢?對(duì)不同菌株培養(yǎng)基的優(yōu)化的目的不同,如為了提高菌體數(shù)、提升抑菌活性、提高產(chǎn)蛋白酶的能力等。芽胞桿菌能分泌高分子量和結(jié)構(gòu)多樣的胞外多糖(EPS)以抵抗環(huán)境壓力,EPS由于其高水溶性和截留率,在食品工業(yè)中被廣泛用作增稠劑和乳化劑,其具有降低膽固醇、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫能力的作用[51]。解淀粉芽胞桿菌DMBA-K4可生產(chǎn)胞外多糖,添加蔗糖可優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,使胞外多糖產(chǎn)量達(dá) 171.31 mg/L,較原始條件提高155.7%;抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DMBA-K4 所產(chǎn)胞外多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性,當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),其 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 自由基清除率達(dá)78.6%,對(duì)·OH 的清除率為75.47%,該研究為微生物胞外多糖的工業(yè)生產(chǎn)提供理論支持,豐富了新型微生物多糖的應(yīng)用前景[52]。HN菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后,采用100 L發(fā)酵罐對(duì)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證,在9 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,24 h后達(dá)到穩(wěn)定期,菌液濃度達(dá)35.6×108cfu/mL,最高芽胞濃度達(dá)到30.4×108cfu/mL;100 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)表明,37 ℃發(fā)酵26 h活菌濃度可達(dá) 37.0×108cfu/mL,芽胞濃度為33×108cfu/mL[53]。

解淀粉芽胞桿菌能產(chǎn)生多種多樣的生物酶,Shang等[55]從健康藏豬的糞便中分離一株能產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽胞桿菌TL106,經(jīng)基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),其包括β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因,并探索了其纖維素降解能力,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵上清液含淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶,這些酶對(duì)小麥和青稞粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、淀粉、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖均具有較好的降解效果。解淀粉芽胞桿菌L-S60有較寬酸堿耐受性,能產(chǎn)多種酶,包括蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶,對(duì)多種病原真菌有抑制作用,王卉等[56]優(yōu)化了L-S60固態(tài)發(fā)酵工藝,其最佳固體培養(yǎng)基組成的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為花生餅粉∶麥麩∶棉粕為53∶35∶12;最佳固體發(fā)酵條件為溫度35 ℃、接種量30%(體積分?jǐn)?shù))、料水質(zhì)量比1∶0.45、裝瓶量40%,發(fā)酵時(shí)間42 h;L-S60菌落數(shù)達(dá)2.42×1010cfu/g。顯然,研究解淀粉芽胞菌酶的合成的優(yōu)化對(duì)應(yīng)用是十分有意義的。

從上述報(bào)道可以總結(jié)出下列規(guī)律：發(fā)酵中添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖為碳源,添加胰蛋白胨、花生餅粉、尿素、豆粕、牛肉膏、酵母膏作為氮源能得到良好的發(fā)酵效果;磷酸鹽可作為最佳緩沖溶液,加入適當(dāng)Mn2+和 Ca2+有助于芽胞形成。對(duì)于培養(yǎng)條件而言,發(fā)酵溫度一般控制在28～40 ℃之間,30 ℃左右比較普遍;初始pH在6.0～7.3之間,一般控制在7.0左右比較適宜;轉(zhuǎn)速在150～180 r/min之間;接種量一般在3%～6%(體積分?jǐn)?shù))范圍內(nèi);裝液量(50～100) mL/250 mL比較合適;發(fā)酵時(shí)間跨度較大在12～60 h之間,但25～30 h內(nèi)比較普遍。了解上述規(guī)律,可在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件時(shí)作為必要參考。

3 解淀粉芽胞桿菌其他優(yōu)化方法

近年來,隨著對(duì)解淀粉芽胞桿菌研究的不斷深入,出現(xiàn)了培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件優(yōu)化的新方法,包括多參數(shù)優(yōu)化、結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化、自適應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練優(yōu)化等。

3.1 解淀粉芽胞桿菌多參數(shù)優(yōu)化

王濤等[57]以平板菌落直徑、培養(yǎng)后活菌濃度為指標(biāo),對(duì)解淀粉芽胞桿菌841種子保存、活化方式和發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉和大豆蛋白粉用量,以及發(fā)酵后期調(diào)控進(jìn)行篩選和優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn),841菌株最佳保存條件為甘油30%,溫度-64 ℃,先采用PDA活化,并經(jīng)過一次48 h活化和24 h二次活化效果最佳;種子培養(yǎng)后17～18 h進(jìn)行轉(zhuǎn)菌為最佳時(shí)間,酵母粉和大豆蛋白粉最佳濃度分別為20、40 g/L;通過補(bǔ)料和流加氨水將pH控制在7.0～7.2作為發(fā)酵后期調(diào)控方法;發(fā)酵時(shí)間可延長(zhǎng)至72 h;在100 L發(fā)酵罐上進(jìn)行高密度發(fā)酵,濃度可達(dá)常規(guī)發(fā)酵的100倍。多參數(shù)優(yōu)化需要進(jìn)行幾次,最終才能達(dá)到很好的效果。

3.2 解淀粉芽胞桿菌BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由Rumelhart和McClelland提出,是一種按照誤差逆向傳播算法訓(xùn)練的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。周廣麒[58]為了提高解淀粉芽胞桿菌抑菌活性,運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化了Q-426發(fā)酵培養(yǎng)基組分,并利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)抑菌活性進(jìn)行了研究,優(yōu)化后培養(yǎng)基最佳配方(g/L)：葡萄糖3.92、牛肉膏5.00、NH4Cl 0.19、MgCl23.83,并以此作為輸入數(shù)據(jù),將抑菌活性作為輸出數(shù)據(jù),建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明,優(yōu)化后抑菌圈直徑由24 mm增加到29 mm,并計(jì)算訓(xùn)練BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)抑菌圈直徑擬合值與實(shí)際值之間相對(duì)誤差、相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值,同時(shí),計(jì)算測(cè)試BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)抑菌圈直徑預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相對(duì)誤差、相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值,最后證實(shí)建立基于培養(yǎng)基成份的抑菌圈直徑BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型是可行的?？梢?利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化方法能更準(zhǔn)確、更方便地找到最佳培養(yǎng)基優(yōu)化方案。

3.3 解淀粉芽胞桿菌BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與適應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練比較

劉爽等[59]運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化共培養(yǎng)的解淀粉芽胞桿菌Q426和Q-12培養(yǎng)基,確定優(yōu)化培養(yǎng)基組成(g/L)：MgSO4·7H2O 0.91、檸檬酸鈉3.31、酵母粉16.10、NH4Cl 2.0、K2HPO41.5及KH2PO40.6,優(yōu)化后抑菌圈直徑由27 mm增加到31 mm;再以培養(yǎng)基組成作為輸入數(shù)據(jù),將抑菌圈直徑作為輸出數(shù)據(jù),建立了基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和自適應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練模型,通過比較訓(xùn)練結(jié)果均方誤差和平均相對(duì)誤差,證明了自適應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練效果優(yōu)于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練效果。可見,隨著計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)模型的應(yīng)用,勢(shì)必會(huì)簡(jiǎn)化優(yōu)化程序,獲得簡(jiǎn)單易行的優(yōu)化手段。

4 解淀粉芽胞桿菌重要的工業(yè)和商業(yè)化產(chǎn)品的應(yīng)用

微生物殺菌劑就是利用微生物及其代謝產(chǎn)物開發(fā)的一類殺菌劑。解淀粉芽胞桿菌可以定植在植物根際,繁殖迅速,對(duì)多種植物病原菌具有良好的抑制效果。如表5所示,解淀粉芽胞桿菌作為殺蟲劑在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少,國(guó)外特別是德國(guó)的巴斯夫(BASF)和 美國(guó)Certis應(yīng)用較早、較成熟,產(chǎn)品較多。國(guó)內(nèi)幾乎沒有種衣劑的登記,國(guó)外已開始將微生物作為種子處理的一種新手段,就解淀粉芽胞桿菌而言,美國(guó)和德國(guó)已經(jīng)取得若干種子處理劑的登記。隨著對(duì)解淀粉芽胞桿菌及其產(chǎn)生的有效抗菌物質(zhì)的深入研究,其生防優(yōu)勢(shì)越來越明顯,并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。但是,與國(guó)際前沿相比,我國(guó)在對(duì)解淀粉芽胞桿菌的研究還有待進(jìn)一步深入,產(chǎn)業(yè)開發(fā)也有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

表5 解淀粉芽胞桿菌重要的工業(yè)和商業(yè)化產(chǎn)品的應(yīng)用[60-61]

5 展 望

解淀粉芽胞桿菌是FDA認(rèn)定的安全級(jí)(GRAS)菌株,在綠色生物農(nóng)藥、工業(yè)酶制劑、大宗化學(xué)品等生產(chǎn)上具有突出優(yōu)勢(shì)。解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)成本低、發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定等特點(diǎn)使其具有成為生防菌劑的優(yōu)勢(shì),其能促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng),防治作物病害,改善土壤環(huán)境;應(yīng)用于農(nóng)業(yè)能消除化學(xué)農(nóng)藥帶來的土壤營(yíng)養(yǎng)失衡、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降等弊端,符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求。解淀粉芽胞桿菌也是一類能夠合成多種生物活性化合物如抗菌蛋白、酶、脂肽、氨基酸、核苷酸和胞外多糖等重要的平臺(tái)化微生物,在工業(yè)、食品、醫(yī)療和日化等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

截至目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于解淀粉芽胞桿菌的抗菌物質(zhì)研究主要集中在目標(biāo)菌株的篩選,以及抗菌成分的分離、純化、鑒定、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化以及抗菌物質(zhì)的表征和作用機(jī)理上。芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)雖然很多,但單一抗菌成分的收率低,純化工藝復(fù)雜,難以滿足農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品等行業(yè)對(duì)抗菌物質(zhì)日益增長(zhǎng)的需求。因此,尋找合適的方法同時(shí)提高抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量和使用效率是未來研究和開發(fā)的重要方向。

針對(duì)解淀粉芽胞桿菌開展更多產(chǎn)物的人工合成通路設(shè)計(jì)和代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)、底盤的適配性組裝與優(yōu)化等,將進(jìn)一步豐富該底盤菌株在生物工程領(lǐng)域中的運(yùn)用;隨著分子生物學(xué)等高新技術(shù)的發(fā)展,解淀粉芽胞桿菌的鑒定必將更加科學(xué)、快捷和準(zhǔn)確,解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝也必然日臻完善;隨著更先進(jìn)的基因工程、蛋白質(zhì)工程及發(fā)酵工程等手段用于解淀粉芽胞桿菌的細(xì)胞改造和發(fā)酵優(yōu)化,解淀粉芽胞桿菌的應(yīng)用必將有更好的前景。