陳麗媛, 朱萬芹, 孫翠煥, 李劍梅, 陳 杰, 張疏雨, 柴林山, 趙博倫

(遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草、北蟲草,屬子囊菌亞門(Ascomycota)核菌綱(Pyrenomycetes)球殼目(Sphaeriales)麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)真菌[1]。具有降血糖、降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化和免疫調節(jié)等藥理作用[2-4],作為傳統(tǒng)藥食兩用真菌,因其營養(yǎng)及經(jīng)濟價值備受人們喜愛,我國自20世紀80年代發(fā)現(xiàn)并分離蛹蟲草以來,栽培技術發(fā)展迅速,已初步實現(xiàn)規(guī)?；N植[5-6],且不受季節(jié)限制。一直以來栽培原料主要為大米、麥粒[7-8],原料成本遠遠高于其他食用菌品種[9-10]。我國是農業(yè)大國更是人口大國,資源短缺,耕地有限,節(jié)糧減損關系國家發(fā)展穩(wěn)定[11-13]。蛹蟲草種植的經(jīng)濟效益高于傳統(tǒng)基礎農業(yè),已經(jīng)成為部分農民脫貧致富的支柱產業(yè),隨著農民種植技能的提高和成熟,種植規(guī)模不斷擴大,產生大量蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物,質量約是蛹蟲草干品的6～8倍,原料浪費達30%,給生產環(huán)境帶來了巨大壓力和困擾[14],培養(yǎng)基廢棄物亟待處理。目前,培養(yǎng)基廢棄物缺乏有效的再利用途徑,污染自然生態(tài)環(huán)境和再生產環(huán)境,制約了蟲草產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5]。中國土地沙漠化導致農業(yè)耕地面積不斷減少,能夠作為主食的抗逆性甘薯作物種植在不斷推進。甘薯因抗干旱、耐瘠薄、環(huán)境適應性強、高產穩(wěn)產等特點,已成為我國主要栽培的農作物品種之一,種植面積約1 100萬hm2,占世界甘薯種植面積的65%以上,其栽培面積和產量均居世界首位[15],我國每年生產的甘薯藤[16]高達150億 t以上[15]。除極少部分被利用外大部分被棄置田邊或被焚燒,不僅污染了生態(tài)環(huán)境造成生產的不便,又造成了資源的浪費[17]。甘薯藤具有多種活性成分[18-21],民間中醫(yī)常以甘薯藤作為降血脂、降血糖、預防和治療動脈硬化、心腦血管、癌癥疾病等的輔助治療藥食材,這與蛹蟲草的研究功效一致,為用甘薯藤參與蛹蟲草的培養(yǎng)提供了思路。本研究以農業(yè)廢棄物甘薯藤及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物代替蛹蟲草培養(yǎng)用糧進行蛹蟬栽培,不僅降低污染,變廢為寶,還實現(xiàn)了蛹蟲草可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。麥粒(市售),甘薯藤(當?shù)厥召?,土豆(市售)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①試驗組一級斜面培養(yǎng)基：土豆100 g/L,蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物20 g/L,甘薯藤粉10 g/L,葡萄糖10 g/L,蛋白胨2.5 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,維生素B110 mg/L,瓊脂11 g/L。②試驗組二級液體搖瓶培養(yǎng)基：土豆100 g/L,蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物20 g/L,甘薯藤粉10 g/L,葡萄糖10 g/L,蛋白胨2.5 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,維生素B110 mg/L。③試驗組子實體培養(yǎng)基(質量分數(shù),%)：麥粒10～80,蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物20～80,甘薯藤粒0～20混合,與營養(yǎng)液(MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO42 g/L,甘氨酸0.1 g/L)比例為1 g∶(1.6～1.8) g/mL。④對照組一級斜面培養(yǎng)基：土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,維生素B110 mg/L,瓊脂11 g/L。⑤對照組二級液體搖瓶培養(yǎng)基：土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨5.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,維生素B110 mg/L。⑥對照組子實體出草培養(yǎng)基：麥粒與營養(yǎng)液(MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO42 g/L,甘氨酸0.1 g/L)加入比例為1 g∶(1.6～1.8) g/mL。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蘆丁標準品(純度98%,上海潤捷化學試劑有限公司),無水乙醇(天津市匯航化工公司),NaOH、Al(NO3)3、NaNO2(分析純,天津大茂化學試劑廠),用水為蒸餾水。生物安全柜(BHC-1300IIA/B2,上海立申科學儀器有限公司);分光光度計(723,上海菁華科技儀器有限公司);高效液相色譜儀(Waters2695,Waters公司);電熱鼓風干燥箱(DHG-9240A,上海一恒科學儀器有限公司);水浴鍋(SL-H-4,江蘇榮華儀器制造有限公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ-50DA,昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(AL 204,梅特勒-托利多儀器有限公司);立式恒溫搖床(上海世平儀器設備有限公司);萬能粉碎機(常州瞬干干燥設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 主要培養(yǎng)原料的獲得 ①甘薯藤粒(Sweetpotato stem Granules,SSG)、甘薯藤粉獲得方法：挑選出秋季采完甘薯后新鮮、無霉變、無腐爛、非木質化的甘薯藤,洗凈,淋干水分,放入粉碎機中粉碎成2～3 cm小段,置于鼓風干燥箱中60～80 ℃烘干至含水量達到8%～12%裝袋備用。根據(jù)需要：粉碎至4～8目,得甘薯藤粒;粉碎至20～40目,得甘薯藤粉。②蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物獲得方法：挑選無霉變、無雜菌污染、無污物,蛹蟲草菌絲體豐富的采收完蛹蟲草子實體的新鮮培養(yǎng)基,并剔除子實體殘段做為原料,該廢棄物經(jīng)過子實體胞外酶酶解降低了韌性,易于斷裂?？捎萌啻隀C搓碎分散,粒徑0.4～0.6 cm,置于鼓風干燥箱中60～80 ℃烘干至含水量達到8%～12%裝袋備用。

1.2.2 一級斜面菌種馴化 試驗組：將土豆、蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物、甘薯藤粉煮沸20～25 min,過濾得濾液,分別加入葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、瓊脂充分溶解,裝入試管,121 ℃滅菌30 min,無菌接入蛹蟲草斜面菌種,18～22 ℃避光培養(yǎng),待菌絲長滿斜面后低溫保存。對照組：采用對照組一級斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)相同菌種,菌種培養(yǎng)方法同試驗組。

1.2.3 蛹蟲草二級液體種子制備 試驗組：將土豆、蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物、甘薯藤粉一起煮沸20～25 min,過濾得濾液,分別加入葡萄糖、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、維生素B1,無菌接入一級斜面馴化菌種,18～22 ℃,140 r/min培養(yǎng)3.5～4.5 d,待菌絲健壯、菌球豐富,停止培養(yǎng)。對照組：二級液體菌種制備采用對照一級斜面菌種及對照組二級液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)方法同試驗組,二級液體菌種培養(yǎng)4.5～5.0 d。

1.2.4 蛹蟲草子實體培養(yǎng)基制備 試驗組營養(yǎng)液配制：MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO42 g/L,甘氨酸0.1 g/L;麥粒10%～80%,蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物10%～80%,甘薯藤粉0～20%混合(表1),與營養(yǎng)液比例為1 g∶(1.6～1.8) g/mL;采用500 mL容量罐頭瓶,每瓶裝量35 g,將固體料稱好混勻倒入培養(yǎng)瓶中,按比例加入營養(yǎng)液,上覆蓋聚乙烯膜,用橡皮筋扎緊。121 ℃,滅菌60～70 min。按培養(yǎng)料6%～8%(體積分數(shù))無菌接入二級液體菌種,18～22 ℃避光培養(yǎng),待白色菌絲長滿并覆蓋瓶內培養(yǎng)料表面時,進入轉色階段,光照強度200～400 Lx,空氣濕度60%～80%;待菌絲顏色轉至橘黃色,原基突起長出時,用無菌針于培養(yǎng)瓶瓶口的聚乙烯膜上均勻扎孔透氣,空氣濕度保持85%～95%,待蛹蟲草子實體頂端微膨大長至瓶口處時采收。對照組出草培養(yǎng)基采用麥粒培養(yǎng)基,營養(yǎng)液同試驗組,出草培養(yǎng)同試驗組(表1)。

表1 蛹蟲草子實體培養(yǎng)基不同比例配料處理

1.2.5 試驗數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件分析處理,不同處理間的差異顯著性采用LSD法檢驗。采用Microsoft Excel 2016軟件分析數(shù)據(jù),試驗數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 一級斜面菌種生長狀況

試驗組中盡管降低了土豆、蛋白胨等營養(yǎng)成分,對照組及試驗組菌絲粗壯、致密、整齊,質量好,均可使用,但試驗組菌種生長速度較快,滿管時間較短,說明在培養(yǎng)基中加入的蛹蟲草廢棄物與甘薯藤粉對蛹蟲草菌絲生長有一定的促進作用,且使菌種得到了初步馴化。

2.2 二級蛹蟲草液體種子生長狀況

從表2可看出,試驗組與對照組生長狀況有一定差別,試驗組中菌球稍小于對照組,菌球均勻度更好,懸浮性好,說明菌種生長狀態(tài)好,使用時菌球更容易分散,子實體更易于均勻分布。同時試驗組菌種生長周期短于對照組,這可能因為蛹蟲草廢棄物酶解后含有的小分子物質[22-23]及甘薯藤粉中的蛋白質、糖分、氨基酸等[24-27]營養(yǎng)物質提供了充足的營養(yǎng)需求和某些促生長因子,說明添加甘薯藤粉和蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物在一定程度上可促進菌絲及子實體生長,提升了菌種活力且使菌種得到了再馴化。

表2 蛹蟲草二級菌種生長狀態(tài)

2.3 蛹蟲草子實體萌發(fā)情況

從表3可看出,試驗組菌絲萌發(fā)時間均早于對照組,分別為24～25.7 h和28 h,菌絲覆滿料面的時間比對照組時間短且差異顯著,說明蛹蟲草菌絲在以添加不同比例甘薯藤粒及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物替代料上生長速度較快,見光轉色快,形成原基早。原基萌發(fā)率一致均達到100%,說明蛹蟲草菌絲在添加不同比例的甘薯藤粒及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物上均能萌發(fā)。同時生長周期縮短,在一定程度上減少了人力物力,節(jié)約了能源。

表3 蛹蟲草子實體萌發(fā)情況

2.4 蛹蟲草子實體的生物學性狀

由表4中蛹蟲草子實體生物學指標可以看出,試驗組T1～T7和對照組CK子實體在直徑、數(shù)量、畸形率、生物學效率[28]及生長周期等方面存在一定差異,試驗組T3～T7的子實體直徑小于對照組且差異顯著,但子實體數(shù)量多于對照組,T6～T7子實體過細品相不好;從行業(yè)內關注的生物學效率來看,試驗組T1～T2組內差異不顯著,與CK組間差異也不顯著,T4～T7與CK差異顯著,但T6～T7生物學效率偏低,而T3～T5略高于對照組,這說明甘薯藤及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物對子實體產量有一定影響;試驗組中T3～T5的子實體畸形率低、差異顯著且品相好,商品價值高,試驗組T1～T7的生長周期短于對照組,對畸形率及生長周期的影響趨勢與李斯陶等[28]的研究一致,不同之處可能緣于用糧種類、菌渣、營養(yǎng)液、菌種、添加方式不同?？s短生長周期有利于節(jié)約能源。綜合來看T3～T5生物學指標較好。

表4 蛹蟲草子實體的生物學指標

2.5 蛹蟲草子實體主要功效成分分析

蛹蟲草子實體功能指標如表5所示,7個試驗組蛹蟲草子實體中蟲草素、黃酮含量與對照組有一定差異。黃酮類含量均明顯高于對照組,蟲草素含量總體存在隨著農用廢棄物添加量增加而增加的趨勢,這與何歡等[29]研究結果一致,說明以一定比例的農業(yè)廢棄物甘薯藤及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物作為替代料提高了蛹蟲草子實體品質。但與表4比較發(fā)現(xiàn),從生長周期、生物學效率、功能指標可看出試驗組T4～T5較佳,綜合來看從生物學效率、蛹蟲草功能指標的提升及節(jié)糧考慮T3～T5較佳。即一級種子培養(yǎng)基中加入蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物20 g/L和甘薯藤粉10 g/L,二級種培養(yǎng)基中加入蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物20 g/L、甘薯藤粉10 g/L,蛹蟲草子實體栽培料中蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物占32%～45%,甘薯藤粒占10%～15%,二者比例為(3～4)∶1時,經(jīng)過科學的培養(yǎng)方法栽培效果好。試驗組T6～T7栽培效果不理想,有待改進。綜合來看,本研究首次嘗試將蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物和甘薯藤用于培養(yǎng)蛹蟲草,替代培養(yǎng)料用糧,具有一定的經(jīng)濟效益,同時兼有更明顯的生態(tài)效益和社會效益。

表5 蛹蟲草子實體功能指標

3 討 論

本研究結果表明,利用甘薯藤及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物部分替代蛹蟲草培養(yǎng)料是可行的[28-29],且在節(jié)糧減排、降低成本、提高子實體品質、縮短生長周期等方面有一定優(yōu)勢[30]。一級種子中加入20 g/L蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物和10 g/L甘薯藤粉,二級種中加入蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物20 g/L、甘薯藤粉10 g/L,蛹蟲草子實體栽培料中蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物占32%～45%,甘薯藤粒占10%～15%,二者比例為(3～4)∶1時,經(jīng)過科學的培養(yǎng)方法栽培蛹蟲草效果好。在菌種培養(yǎng)過程中用甘薯藤及蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物替代部分土豆、葡萄糖、蛋白胨等,可使成本降低并使菌種得到馴化,提高菌種活力。本研究改善了蛹蟲草品相及生物學指標,提高了蛹蟲草子實體中蟲草素、黃酮等的含量,改善了蛹蟲草品質。

在蛹蟲草菌種培養(yǎng)基中添加粒徑較細的甘薯藤粉時,甘薯藤中的活性物質易被充分吸收,更利于對蛹蟲草菌種的馴化;在子實體培養(yǎng)料中添加粒徑稍粗的甘薯藤粗粒,由于甘薯藤自身的組織結構及其較粗的粒徑具有很好的透氣性,使其在與蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物混合后,仍能保持較高的孔隙率,同時還具有很好的保水效果和緩釋功能,一方面可在蛹蟲草子實體出草培養(yǎng)時特別是在長出子實體原基后,大大提高菌絲生長的換氣效果,進而可提高蛹蟲草的生長速度,縮短培育周期,另一方面有利于菌絲生長過程中對甘薯藤中營養(yǎng)物質的吸收,進而提高蛹蟲草子實體的生物學指標和功能指標[31-33]。

本研究利用甘薯藤、蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物生產蛹蟲草的方法,使廢棄物中的淀粉、蛋白質、糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質及蛹蟲草胞外酶酶解產生的小分子物質被充分利用,促進了農業(yè)廢棄物資源高效生態(tài)循環(huán)利用,不僅可以減少資源浪費和環(huán)境污染,而且可以節(jié)約生產原料用糧,降低生產成本。甘薯藤質輕且富含礦物質、維生素、柔性纖維、黃酮類等物質,可提升蛹蟲草品質。甘薯藤資源豐富、低成本、高營養(yǎng)是其優(yōu)勢,將其充分利用起來,變廢為寶,才能利農惠農,調動農民生產積極性,促進農業(yè)生產。同時,利用蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄物生產蛹蟲草,不需遠途運輸,可原位就地取料,既方便又降低了運輸成本,極大地促進了蛹蟲草產業(yè)的高效可持續(xù)性發(fā)展。