李佳珣, 葉雨寒, 胡心怡, 張秋香, 趙建新

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

近年來,慢性創(chuàng)面感染的發(fā)病率不斷上升,傷口愈合緩慢影響了患者的生活質(zhì)量[1-2]。慢性創(chuàng)面感染主要受多種微生物的影響,這些微生物定植在傷口上形成生物膜,并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物進(jìn)而延緩傷口的愈合[3-4],其中最常見的病原菌為銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌[5],二者具有協(xié)同作用共同形成毒力和抗生素耐受性更強(qiáng)的生物膜[6]。生物膜態(tài)病原菌對大部分慢性創(chuàng)面感染有實(shí)質(zhì)性的影響,進(jìn)而導(dǎo)致傷口愈合不良[7]。病原菌生物膜的形成與群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控密不可分[8],其中,銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的lasR和rhlI基因[9-10]和金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的SarA和RNAIII基因[11-12]與生物膜形成和致病菌的毒力因子表達(dá)密切相關(guān)。隨著對益生菌研究的不斷深入,在皮膚健康領(lǐng)域應(yīng)用益生菌療法已有一些研究和嘗試,如植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌[13-14]。Onbas等[15]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌F10上清液對皮膚慢性創(chuàng)面致病菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生長具有抑制作用。Moreira等[16]研究表明,小鼠口服鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.3724可以促進(jìn)皮膚傷口愈合并減少疤痕形成。然而目前的研究主要集中在乳桿菌對單菌感染的抑制效果評價上,乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌混合生物膜形成及其種間群體感應(yīng)的影響鮮有報道。本研究通過探究乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成、抑菌效果、群體感應(yīng)信號分子AI-2的產(chǎn)量等指標(biāo)綜合評價乳桿菌的抗感染潛力,采用PCA等分析方法篩選得到具有優(yōu)良特性的益生菌菌株,最后評價其對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜和群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的影響,以期得到具有抗感染潛力的乳桿菌,為其應(yīng)用于慢性創(chuàng)面敷料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM233(分離自昂立一號口服液)、CCFM595(分離自四川眉山泡菜)、CCFM11(分離自發(fā)酵蔬菜)、CCFM10(分離自發(fā)酵蔬菜)、CCFM634(分離自四川內(nèi)江泡菜)、CCFM8724(分離自發(fā)酵蔬菜)、CCFM361(分離自土壤)、卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)FHBZX 13M4、FHNFQ 15L11、FCQJJ 9M2(均分離自糞便)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM(分離自商業(yè)化酸奶發(fā)酵劑)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)FAHWH 30-1、FAHWH 26-1、FBJCY 3-1、FBJCY 2-1(均分離自糞便)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)D-6-A122、D-9-A28(均分離自酸奶)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)17312(分離自重慶泡菜水),上述乳桿菌現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心;哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)BB170由渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院勵建榮教授課題組惠贈,現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC1.1861、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC29213購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉 10.0 g,蒸餾水1.0 L,配制固體培養(yǎng)基時添加20 g瓊脂,用于培養(yǎng)生物膜的LB培養(yǎng)基則需添加0.1 g蔗糖;MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g,牛肉膏10.0 g,胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,無水乙酸鈉5.0 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸鎂0.58 g,硫酸錳0.25 g,吐溫-80 1.0 mL,蒸餾水1.0 L,pH調(diào)至6.2～6.4。以上培養(yǎng)基均115 ℃高壓滅菌20 min;AB培養(yǎng)基：氯化鈉0.3 mol,硫酸鎂 0.05 mol,酸水解酪蛋白 0.2 g,蒸餾水1.0 L,115 ℃ 高壓滅菌20 min后加入10 mL 1 mol/L的無菌磷酸鉀緩沖液,10 mL 0.1 mol/L的無菌精氨酸溶液和20 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))無菌甘油;2216E培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 結(jié)晶紫、甲醇、冰醋酸、三氯甲烷、異丙烷、無水乙醇、胰蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、牛肉膏、無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫-80、精氨酸、甘油、蔗糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,酵母提取物購自賽默飛世爾科技有限公司,酸水解酪蛋白購自上海碧迪醫(yī)療器械有限公司,RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司,全波長酶標(biāo)儀(Multiscan Go,賽默飛世爾科技有限公司);實(shí)時熒光定量PCR儀(CFX96, 上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);臺式冷凍高速離心機(jī)(Centrifuge 5424R,Eppendorf公司);基因擴(kuò)增儀(T100,上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);微量核酸檢測儀(NanoPhotometer?N120,德國因普恩中國有限公司)?？祵?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自南通市海之星實(shí)驗(yàn)器材有限公司,qPCR 96孔板、premix Mix購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司,無酶槍頭購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 取出-80 ℃保藏的乳桿菌,將菌液以體積比1∶50分別接種于5 mL的MRS培養(yǎng)基中,于微需氧恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。將金黃色葡萄球菌CGMCC1.1861、銅綠假單胞菌ATCC29213接種于LB培養(yǎng)基中,于需氧振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h。哈維氏弧菌BB170接種于2216E培養(yǎng)基,于需氧振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃,200 r/min 培養(yǎng)18 h。活化3代后用于實(shí)驗(yàn)。為培養(yǎng)雙菌生物膜,將活化后的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于0.1 g/L(質(zhì)量濃度)蔗糖的LB液體培養(yǎng)基中,使菌懸液濃度達(dá)到約107cfu/mL。為得到乳桿菌無菌上清液,將乳桿菌的過夜培養(yǎng)液于4 ℃以6 000×g離心10 min,為排除酸的影響,取一半上清液調(diào)pH至中性(pH=7),用0.22 μm的濾膜過濾除菌,另一半上清液直接過濾除菌,置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 結(jié)晶紫法測定致病菌生物膜量 采用結(jié)晶紫染色法,在96孔板中分別加入金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌懸液各75 μL,隨后將乳桿菌上清液加入孔板中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。陰性對照組以同等體積的MRS培養(yǎng)基代替。培養(yǎng)結(jié)束后去除培養(yǎng)液,用1 mol/L的磷酸緩沖液(Phosphate buffer saline, PBS)小心清洗生物膜2遍,室溫靜置晾干。向每孔中加入100 μL甲醇以固定生物膜,10 min后棄去甲醇,自然晾干,加入100 μL 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的結(jié)晶紫溶液,將生物被膜染色30 min。染色結(jié)束后用PBS清洗2遍,每孔以100 μL 33%(體積分?jǐn)?shù))的冰醋酸溶解,用酶標(biāo)儀讀取OD600吸光度值。每組設(shè)置6個平行[17]。

1.2.3 抑菌圈法測定乳桿菌對致病菌生長的抑制作用 為篩選得到不抑制銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌生長但能夠顯著抑制致病菌生物膜形成的乳桿菌,采用雙層平板打孔法,在素瓊脂上倒一層LB固體培養(yǎng)基,在其上涂布銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌,隨后在瓊脂上打孔并在孔內(nèi)分別加入200 μL已調(diào)pH的乳桿菌上清液和未調(diào)pH的乳桿菌上清液,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。每組設(shè)置2個平行。

1.2.4 化學(xué)發(fā)光法測定AI-2信號分子 哈維氏弧菌發(fā)光現(xiàn)象受到群體感應(yīng)的調(diào)控,其中哈維氏弧菌BB170菌株僅識別AI-2信號分子從而發(fā)光,發(fā)光強(qiáng)度隨AI-2分子的含量升高而增大。為探究乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響,本研究采用哈維氏弧菌BB170化學(xué)發(fā)光法檢測乳桿菌自身產(chǎn)生AI-2能力以及乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間AI-2的影響,按1.2.2所述培養(yǎng)生物膜,培養(yǎng)結(jié)束后收集、過濾獲得雙菌培養(yǎng)的無菌上清液,備用?；罨蟮墓S氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h,調(diào)節(jié)菌液OD600為0.8左右,再用無菌新鮮AB培養(yǎng)基按1∶2 000(體積比)稀釋該菌液,混勻備用。按1∶50(體積比)將乳桿菌上清液或上述收集的雙菌培養(yǎng)上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。28 ℃、100 r/min培養(yǎng)5 h,避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標(biāo)板中,以多功能酶標(biāo)儀于波長571 nm處檢測哈維氏弧菌BB170化學(xué)發(fā)光情況[18]。

1.2.5 RT-qPCR測定致病菌毒力基因表達(dá) 按1.2.2制備生物膜樣品,用生理鹽水洗脫生物膜并移至無酶離心管中,4 ℃、3 000×g離心2 min,棄上清液,按RNA提取試劑盒提取生物膜RNA,提取后于微量核酸檢測儀測定RNA濃度。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR所用引物如表1所示。反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Green Mix 5 μL;上下游引物各0.5 μL;cDNA 1 μL;無酶ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min、40個循環(huán)(95 ℃ 15 s 55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)、融解曲線(95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃ 0.5 s)。以16S rRNA作為內(nèi)參基因校準(zhǔn)相關(guān)基因的相對mRNA水平,通過2-ΔΔCt法對靶基因進(jìn)行定量分析[19]。

表1 RT-qPCR所用引物

1.2.6 數(shù)據(jù)分析和處理 數(shù)據(jù)分析使用Graphpad Prism 8.4.3、R studio 4.0.1、SPSS軟件,使用One-way anova進(jìn)行方差分析,P< 0.05表示具有顯著性差異,使用Graphpad Prism 8.4.3、R包 ggplot2和PCAtools等進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌對致病菌生物膜量的影響

生物膜對超過90%的慢性創(chuàng)面感染有實(shí)質(zhì)性的影響，會導(dǎo)致傷口愈合不良。由圖1可知，未調(diào)pH的乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌雙菌生物膜的形成均具有顯著的抑制作用，這可能是由于乳桿菌上清液中的酸抑制了雙菌生物膜的形成[24]。而大部分調(diào)pH后的乳桿菌上清液沒有抑制生物膜的效果。由圖1B可知，植物乳桿菌CCFM233、CCFM595，卷曲乳桿菌13M4、15L11、9M2，嗜酸乳桿菌NCFM顯著抑制生物膜的形成，而鼠李糖乳桿菌FAHWH26-1顯著促進(jìn)生物膜的形成。

圖1 乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌雙菌生物膜抑制效果評價Fig.1 Evaluation of the biofilm inhibitory effect of Lactobacillus supernatant on biofilms ofPseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureusA：未調(diào)pH;B：調(diào)pH。*表示與對照組差異顯著(P<0.05)A： Without pH adjustment; B： pH adjustment. * Indicates significant difference from the control group (P<0.05)

2.2 乳桿菌對致病菌生長的影響

未調(diào)pH的乳桿菌上清液顯著抑制生物膜的形成,而大部分調(diào)pH后的乳桿菌上清液沒有抑制生物膜形成的效果,這可能是由于調(diào)pH和未調(diào)pH的乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生長能力的影響不同,因此采用抑菌圈法測定乳桿菌上清液作用于致病菌后抑菌圈直徑,結(jié)果表明(表2),除卷曲乳桿菌15L11、鼠李糖乳桿菌A28、短乳桿菌17312外,其余未調(diào)pH的乳桿菌上清液對兩種致病菌都具有不同程度的抑菌能力,其中植物乳桿菌CCFM233對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均有較大的抑菌圈。而調(diào)pH的乳桿菌上清液均不能抑制菌的生長,因此,調(diào)pH的乳桿菌上清液可能通過群體感應(yīng)等其他方式來調(diào)控生物膜形成。后續(xù)僅對調(diào)pH的乳桿菌上清液進(jìn)行研究。

表2 未調(diào)pH的乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果評價Table 2 Evaluation of the bacteriostatic effect of Lactobacillus supernatant without pH adjustment on P. aeruginosa and S. aureus

2.3 乳桿菌對細(xì)菌間群體感應(yīng)信號分子AI-2產(chǎn)生的影響

為探究乳桿菌對致病菌群體感應(yīng)的影響,使用哈氏弧菌生物發(fā)光法測定乳桿菌自身AI-2產(chǎn)量和其對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間AI-2的影響,由圖2A可知,乳桿菌菌株自身產(chǎn)生的AI-2 信號分子有所差異,其中,植物乳桿菌CCFM233、CCFM11、CCFM10,鼠李糖乳桿菌FBJCY 3-1,短乳桿菌17312產(chǎn)生的AI-2分子較多。乳桿菌的AI-2的產(chǎn)生與其抗菌能力如細(xì)菌素分泌密切相關(guān),AI-2產(chǎn)量越多,其抗菌能力越強(qiáng)[25]。不同乳桿菌菌株對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間AI-2分子的影響也不同,植物乳桿菌CCFM233和CCFM634干預(yù)后,種間的AI-2顯著升高,但植物乳桿菌CCFM233能顯著抑制生物膜的形成,而植物乳桿菌CCFM634則不能,這可能是由于本身AI-2分子的含量差異所導(dǎo)致。

圖2 群體感應(yīng)評價Fig.2 Evaluation of quorum sensingA：乳桿菌自身產(chǎn)生AI-2產(chǎn)量;B：乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間群體感應(yīng)分子AI-2產(chǎn)生的影響。*表示與對照組差異顯著(P<0.05)A： AI-2 production by Lactobacillus; B： Effect of Lactobacillus supernatant on the production of AI-2, a quorum-sensing molecule between P. aeruginosa and S. aureus. *Iindicates significant difference from the control group (P<0.05)

2.4 乳桿菌特性綜合分析

為篩選得到具有抗感染潛力的乳桿菌菌株,采用主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)來評價乳桿菌抑制銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的能力。載荷圖(圖3B)顯示可以分為6個主成分,其中最重要的是第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2),其貢獻(xiàn)率分別為50.9%和49%,其中PC1的特征是乳桿菌上清液調(diào)pH時對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜的抑制效果,PC2的特征是乳桿菌自身AI-2產(chǎn)量和其對種間AI-2的影響。由圖3A可知,PCA得分高的細(xì)菌為植物乳桿菌CCFM233和CCFM634,具有較高的綜合能力。再結(jié)合熱圖(圖3C)分析,熱圖顏色越接近紅色,表示抑菌圈直徑、致病菌生物膜形成量、AI-2產(chǎn)量越高,由此可見,植物乳桿菌CCFM233產(chǎn)生的AI-2信號分子較多,具有良好的抑菌能力,致病菌生物膜形成量最低,因此選擇植物乳桿菌CCFM233做進(jìn)一步研究。

2.5 植物乳桿菌CCFM233對致病菌毒力基因表達(dá)的影響

為探究植物乳桿菌CCFM233對致病菌群體感應(yīng)調(diào)控毒力基因的影響,使用RT-qPCR測定CCFM233上清液干預(yù)后金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的毒力基因表達(dá)能力。銅綠假單胞菌QS受lasI/R系統(tǒng)控制,LasR的抑制可導(dǎo)致下游QS信號的丟失。由圖4可知,在CCFM233干預(yù)后,LasR和rhlI分別下調(diào)了82%和18%,這兩個基因的顯著下調(diào)說明乳桿菌抑制了銅綠假單胞菌的毒力基因表達(dá),進(jìn)而抑制了生物膜形成。負(fù)責(zé)調(diào)控金黃色葡萄球菌生物膜形成和部分毒力因子表達(dá)的SarA基因在CCFM233上清液干預(yù)后顯著下調(diào)(85%),說明了乳桿菌抑制了金黃色葡萄球菌毒力因子表達(dá)。而RNAIII的基因表達(dá)水平與對照組相近,沒有顯著下降。

圖4 植物乳桿菌CCFM233上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum CCFM233 supernatant on gene expression of P. aeruginosa and S. aureus*表示與對照組差異顯著(P<0.05)* Indicates significant difference from the control group (P<0.05)

3 討 論

皮膚的慢性創(chuàng)面存在著生物膜態(tài)的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性細(xì)菌,其能夠在醫(yī)療設(shè)備和人體組織中定殖引起感染,并在臨床環(huán)境中會形成耐抗生素生物膜[26]。金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性細(xì)菌,會分泌多種外毒素,如腸毒素、白細(xì)胞溶血素等,且會在醫(yī)院使用的各種醫(yī)療設(shè)備表面形成生物膜,導(dǎo)致慢性和持續(xù)性感染[27]。近年來乳桿菌在皮膚健康方面應(yīng)用廣泛,Ong等[28]研究表明植物乳桿菌USM8613可以產(chǎn)生植物乳桿菌素,并抑制傷口部位的金黃色葡萄球菌感染進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合,Vagesjo等[29]研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生CXCL12加速小鼠傷口愈合,Fang等[30]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8610改善了特應(yīng)性皮炎。本研究通過評價實(shí)驗(yàn)室保存的乳桿菌菌株對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成、抑菌效果、群體感應(yīng)信號分子AI-2產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)同種不同株的乳桿菌抑制生物膜形成的能力也有所差異。值得注意的是,未調(diào)pH的乳桿菌上清液對兩種致病菌都具有不同程度的抑菌能力,而調(diào)pH的乳桿菌上清液均不能抑制細(xì)菌的生長,說明調(diào)pH的乳桿菌上清液可能通過其他方式調(diào)控生物膜形成,比如調(diào)節(jié)群體感應(yīng)。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了植物乳桿菌CCFM233顯著抑制生物膜的形成,且種間的AI-2顯著升高,李建周等[25]的研究結(jié)果表明乳桿菌通過提高銅綠假單胞菌AI-2的表達(dá)進(jìn)而抑制其形成生物膜,本研究也與該研究結(jié)果一致。

隨后采用PCA等分析方法篩選得到一株益生菌菌株植物乳桿菌CCFM233,該菌株具有優(yōu)良特性和抗感染潛力,自身產(chǎn)生的AI-2產(chǎn)量高且可以顯著抑制致病菌生物膜形成,提高致病菌間的AI-2產(chǎn)量。最后評價植物乳桿菌CCFM233對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜和群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的影響,其顯著下調(diào)了銅綠假單胞菌的LasR和rhlI以及金黃色葡萄球菌的SarA,但RNAIII的基因表達(dá)水平與對照組相近,這可能因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌的QS系統(tǒng)agr可感知環(huán)肽信號分子的局部濃度,并將其轉(zhuǎn)化為特定的基因表達(dá)模式[31],因此RNAIII作為agr系統(tǒng)的主要效應(yīng)器,在CCFM233上清液干預(yù)后,金黃色葡萄球菌的環(huán)肽信號分子濃度有所上升,故RNAIII的基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著下降。

綜上,本研究揭示了植物乳桿菌CCFM233具有抗銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌感染的潛力,為其應(yīng)用于慢性創(chuàng)面敷料及相關(guān)生物制品的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù),乳桿菌自身產(chǎn)生AI-2以及乳桿菌在致病菌生物膜環(huán)境中產(chǎn)生AI-2的能力與其抑制銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌形成生物膜的量效關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。