不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中hsa-miR-125a-5p及其靶基因表達的研究

張瑤楠，劉丹，張廣志，張蔚*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京市海淀區(qū)婦幼保健院，北京 100080)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)指育齡期婦女與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上的自然流產(chǎn)，大多數(shù)專家認為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并進行評估，因為其再次流產(chǎn)的風(fēng)險與已連續(xù)發(fā)生3次者相近[1]。RSA常見原因有胚胎染色體異常、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、免疫功能異常、內(nèi)分泌紊亂、血栓前狀態(tài)等。排除這些已知因素后的RSA由于病因不明，稱為不明原因RSA(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)，約占RSA的50%左右[2]。這些患者因病因不明確得不到有效治療，由此產(chǎn)生沉重的心理和社會負擔(dān)。因此，探索URSA的發(fā)病機制，為該病的治療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)具有十分重要的意義。

課題組前期高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，URSA患者與正常對照組的絨毛組織中有一些差異表達的微小RNA(miRNAs)，其中包括hsa-miR-125a-5p，它在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中表達上調(diào)；經(jīng)過生物信息學(xué)分析預(yù)測到基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)是hsa-miR-125a-5p的可能靶基因(未發(fā)表內(nèi)部資料)。有細胞實驗也提示MMP-2是hsa-miR-125a-5p的靶基因[3]。本研究通過增加樣本量對URSA患者絨毛組織中hsa-miR-125a-5p的表達情況進行驗證，并檢測其可能靶基因MMP-2在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者和正常對照組的絨毛組織中的表達差異，來探討hsa-miR-125a-5p與URSA的可能關(guān)系。

材料與方法

一、研究對象及分組

收集2020年1月至2021年10月期間在北京市海淀區(qū)婦幼保健院計劃生育科因胚胎停育就診的25例URSA患者為URSA組。

納入標準：20歲≤年齡<40歲；血β-HCG檢測和彩超證實為宮內(nèi)妊娠；B超提示胚胎停育，臨床診斷稽留流產(chǎn)；流產(chǎn)時間在妊娠12周內(nèi)；既往有2次及以上自然流產(chǎn)史。

排除標準：合并生殖器官解剖結(jié)構(gòu)異常、患者夫婦或胚胎染色體異常、內(nèi)分泌疾病、免疫功能異常、感染等可能引起流產(chǎn)的疾病或因素。

按照年齡和停經(jīng)時間進行匹配，選取同期28例自愿要求終止妊娠的正常早孕婦女作為對照組。納入標準：既往無流產(chǎn)史；血β-HCG檢測和彩超均為正常早孕，無先兆流產(chǎn)癥狀。

兩組研究對象均排除生殖器官解剖結(jié)構(gòu)異常、染色體異常、內(nèi)分泌異常、免疫異常、感染等疾病和因素。

本研究通過國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會批準。所有患者均進行知情同意。

二、研究方法

1.標本收集：所有患者行負壓吸引流產(chǎn)術(shù)終止妊娠，術(shù)后留取絨毛組織。生理鹽水漂洗后分為2份，一份置于液氮中速凍，置于凍存管保存于-80℃冰箱；一份置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

2.實時熒光定量PCR法檢測絨毛組織hsa-miR-125a-5p表達：取絨毛組織，研磨后使用miRNeasy MicroKit(QIAGEN，德國)提取、純化絨毛中的miRNA。使用紫外分光光度計檢測樣本純度，A260/280≥1.80為合格樣品。采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara，日本)將絨毛 miRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。采用TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus；Takara，日本)進行實時熒光定量PCR，U6為內(nèi)參照基因。使用StepOneTM實時定量PCR系統(tǒng)(ThermoFisher，美國)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，總共40個循環(huán)；95℃ 5 s、60℃ 1 min，95℃ 1 min。反應(yīng)中每個樣本設(shè)3個復(fù)管，取平均值。使用StepOneTMsoftware v2.1軟件對結(jié)果進行分析，應(yīng)用2-△△Ct法計算hsa-miR-125a-5p的相對表達量。

3.實時熒光定量PCR法檢測絨毛組織MMP-2 mRNA表達水平：采用Trizol法提取絨毛組織中的總mRNA，采用SMART MMLV Reverse Transcriptase(Takara，日本)將絨毛mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。采用TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus；Takara，日本)進行實時熒光定量PCR，GAPDH為內(nèi)參照基因。使用StepOneTM實時定量PCR系統(tǒng)(ThermoFisher，美國)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 31 s，總共40個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 1 min。反應(yīng)中每個樣本設(shè)3個復(fù)管，取平均值。使用StepOneTMsoftware v2.1軟件對結(jié)果進行分析，應(yīng)用2-△△Ct法計算MMP-2 mRNA表達量。引物由英濰捷基公司合成(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

4.免疫組化法檢測絨毛組織MMP-2蛋白表達水平：對絨毛組織石蠟切片進行脫蠟、水化處理后滴加3%的H2O2室溫孵育10 min；加入檸檬酸鹽溶液，高壓2.5 min，對切片組織進行修復(fù)；滴加鼠抗人MMP-2單克隆抗體(Abcam，英國)，按照1∶200稀釋，4℃反應(yīng)過夜；PBS緩沖液洗，滴加酶標羊抗鼠IgG聚合物(北京中杉金橋)，37℃反應(yīng)30 min，PBS緩沖液洗；滴加DAB顯色液反應(yīng)5 min，純水沖洗，復(fù)染；切片進行脫水、透明后用中性樹膠封片。

隨機選取6個視野觀察并掃描拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對絨毛組織MMP-2蛋白水平進行定量分析，采用積分光密度(IOD=平均光密度×陽性面積)表示蛋白表達水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、研究對象基本情況比較

本研究納入25例URSA患者流產(chǎn)絨毛組織(URSA組)以及同期28例自愿要求終止妊娠的正常早孕婦女絨毛組織(對照組)。

URSA組患者年齡23～40歲，停經(jīng)時間42～77 d；對照組患者年齡23～40歲，停經(jīng)時間35～77 d；兩組患者的平均年齡、平均停經(jīng)時間及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等基本資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組基本情況比較(-±s)

二、研究對象絨毛組織hsa-miR-125a-5p和MMP-2 mRNA表達量比較

URSA組患者絨毛組織中hsa-miR-125a-5p的相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而MMP-2 mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)(表3)。

表3 兩組間絨毛組織hsa-miR-125a-5p和MMP-2 mRNA表達量比較(-±s)

三、生物信息學(xué)軟件預(yù)測hsa-miR-125a-5p靶基因

使用miRanda軟件預(yù)測hsa-miR-125a-5p的靶基因，參數(shù)為：S≥140、ΔG≤-20 kcal/mol。結(jié)果顯示，hsa-miR-125a-5p的編碼區(qū)域中8個堿基與MMP-2的3’-非翻譯編碼區(qū)(UTR)的堿基互補；預(yù)測hsa-miR-125a-5p可作用于MMP-2的3’-UTR，參與MMP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。提示MMP-2是hsa-miR-125a-5p的潛在靶基因(圖1)。

圖1 hsa-miR-125a-5p與MMP-2的預(yù)測作用位點

四、兩組患者絨毛組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及MMP-2蛋白水平表達比較

對照組絨毛組織形態(tài)規(guī)則，大小一致，滋養(yǎng)層細胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊(圖2A)；URSA組絨毛組織形態(tài)不規(guī)則，大小不一，滋養(yǎng)層細胞結(jié)構(gòu)不完整、排列混亂，外層合體滋養(yǎng)層細胞數(shù)量減少(圖2C)；MMP-2主要表達在合體滋養(yǎng)層細胞胞質(zhì)中(圖2B、2D)；URSA組患者絨毛組織中MMP-2蛋白的表達量顯著低于對照組[(11.15±3.11) vs.(71.67±18.05)，P<0.05)(圖2B、2D，圖3)。

A、B：對照組(B為A方框區(qū)域放大圖)；C、D：URSA組(D為C方框區(qū)域放大圖)；CT 細胞滋養(yǎng)層、SN 合體滋養(yǎng)層。圖2 絨毛組織中MMP-2蛋白染色結(jié)果(免疫組化染色；A/C ×200，B/D ×400)

與對照組比較，*P<0.05圖3 兩組絨毛組織MMP-2蛋白表達量比較

討 論

在妊娠發(fā)生的過程中，囊胚著床后合體滋養(yǎng)層細胞侵入子宮蛻膜并參與子宮螺旋動脈的重塑，進而形成胎盤組織為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)支持。因此，滋養(yǎng)層細胞侵入子宮蛻膜是胎盤形成的關(guān)鍵一步，如果滋養(yǎng)層細胞侵襲受損就會導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

在滋養(yǎng)層細胞侵襲子宮內(nèi)膜的過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)由于可以降解細胞外基質(zhì)、參與細胞外基質(zhì)的重構(gòu)，發(fā)揮著重要的作用[4]。其中MMP-2是妊娠早期滋養(yǎng)層細胞成功侵襲子宮內(nèi)膜的關(guān)鍵酶[5]，可以降解細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白，促進滋養(yǎng)層細胞入侵子宮內(nèi)膜基質(zhì)，保證胎盤形成和妊娠的維持[6]。研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)、先兆子癇、妊娠滋養(yǎng)細胞疾病等異常妊娠患者的胎盤組織及血液中MMP-2表達異常[4，7-8]。

本研究結(jié)果顯示，對照組絨毛組織形態(tài)規(guī)則、大小均一、外層合體滋養(yǎng)層細胞及內(nèi)層細胞滋養(yǎng)層細胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；而URSA組絨毛組織形態(tài)不規(guī)則，滋養(yǎng)層細胞結(jié)構(gòu)不完整、排列混亂、外層合體滋養(yǎng)層細胞數(shù)量減少。URSA組絨毛組織MMP-2 mRNA相對表達量及蛋白表達水平均顯著低于對照組，提示URSA患者滋養(yǎng)層細胞分化出現(xiàn)異常，滋養(yǎng)層薄弱，MMP-2表達減少從而滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力下降[9]。

MMP-2受多種細胞因子的調(diào)控，其中一種調(diào)控因子就是miRNA。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，通過互補的方式與其靶mRNA的3’-UTR結(jié)合，對靶基因起到降解或抑制的作用，從而調(diào)控靶基因的表達。本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測到MMP-2是hsa-miR-125a-5p的靶基因，hsa-miR-125a-5p可作用于MMP-2的3’-UTR，參與MMP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

miR-125a是miR-125家族中的一員，根據(jù)其轉(zhuǎn)錄方向不同可產(chǎn)生兩種成熟miR-125a，即miR-125a-3p 和miR-125a-5p。研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等多種疾病中發(fā)揮重要功能，對細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化及凋亡起重要作用[10-13]。在早期胚胎停育及正常早孕絨毛組織滋養(yǎng)層細胞及間質(zhì)細胞中也均有miR-125a的表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a的異常表達可能與自然流產(chǎn)、先兆子癇等異常妊娠有關(guān)[14-17]。

課題組前期高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-125a-5p在URSA組中表達上調(diào)(內(nèi)部資料)。本研究顯示URSA組絨毛組織hsa-miR-125a-5p的相對表達量明顯高于對照組，與前期測序結(jié)果表達趨勢一致，表明hsa-miR-125a-5p確實在URSA患者的絨毛組織中高表達，可能與URSA發(fā)病機制有關(guān)。朱旗[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-125a過表達抑制了絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的增殖與遷移，細胞代謝活性降低，從而導(dǎo)致胚胎停育的發(fā)生。本研究中URSA組絨毛組織hsa-miR-125a-5p表達顯著上調(diào)，而其可能靶基因MMP-2的表達顯著下調(diào)，推測hsa-miR-125a-5p過表達抑制了MMP-2的表達，從而導(dǎo)致胚胎滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力下降，胚胎侵入子宮蛻膜能力受損，胚胎著床過淺，胎盤形成不良，影響妊娠的持續(xù)，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。

綜上，根據(jù)研究結(jié)果推測URSA患者絨毛滋養(yǎng)層細胞hsa-miR-125a-5p表達上調(diào)抑制了其可能靶基因MMP-2表達從而導(dǎo)致滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力下降，胚胎侵入子宮蛻膜能力受損，引發(fā)胚胎停育，為URSA的可能發(fā)病機制提供了研究思路。未來需加大樣本量對這一可能機制進行深入的探索和研究。