許艷麗，呂雪峰，柴 婷，賽迪古麗，胡 昕，王 樂

(新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆烏魯木齊 830012)

新疆山羊是我國絨肉兼用型地方山羊品種，在新疆各地均有分布，其中心產(chǎn)區(qū)為東疆的哈密。新疆山羊絨毛品質(zhì)優(yōu)良且具有較好的產(chǎn)肉性能，在新疆畜禽種質(zhì)資源中占有重要的地位。山羊絨是我國具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的毛絨資源之一，享有“軟黃金”的美譽(yù)。毛色是絨山羊的一個(gè)重要生產(chǎn)性狀，可作為重要的遺傳標(biāo)記，用于分子育種，是決定山羊絨經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要因素之一。新疆山羊被毛以白色為主，褐色和黑色次之。白色有利于毛紡業(yè)加工，更受消費(fèi)者的青睞。哺乳動物毛色的形成受多個(gè)基因的作用，同時(shí)也受外界環(huán)境的影響。在黑色素形成的信號通路中黑色素皮質(zhì)受體-1基因(MC1R)、酪氨酸酶基因(TYR)、刺鼠信號蛋白基因(Agouti)、肥大/干細(xì)胞生長因子受體基因(KIT)、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)等對毛色形成發(fā)揮著重要的作用[1]。近年來，對動物毛色候選基因的研究很多，但有關(guān)新疆山羊毛色基因的研究較少。筆者以新疆山羊MC1R、Agouti和MITF基因?yàn)檠芯繉ο?，采用qRT-PCR分析其mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的差異表達(dá)，分析3個(gè)毛色基因與新疆山羊毛色的關(guān)系，為深入研究MC1R、Agouti和MITF基因?qū)γ纬傻淖饔锰峁├碚撘罁?jù)，為通過毛色選擇開展新疆山羊的選育擴(kuò)繁奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)樣品。在新疆塔城地區(qū)和布克賽爾牧場選取不同毛色(白色、褐色、黑色)成年新疆山羊各3只，使用皮膚取樣器進(jìn)行皮膚樣品采集，置于凍存管中液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑及儀器。

1.1.2.1主要試劑。TRIzolTMReagent(ambion)、5×All-In-One RT MasterMix(ambion)、EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-Low Rox(ambion)、M5 HiClear DL2000 DNA marker(聚合美)。

1.1.2.2主要儀器。高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher，美國)；Real Time PCR instrument(ABI，美國)；電泳槽(北京六一)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)；微量分光光度計(jì)(杭州奧盛)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。將采集的皮膚組織液氮研磨，采用Trizol法提取不同毛色新疆山羊皮膚組織總RNA，使用微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度，再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照5× All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20 ℃下保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1.2.2主要儀器。引物設(shè)計(jì)與合成。依據(jù)NCBI網(wǎng)站上已公布的MC1R、Agouti和MITF基因序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì)，選用GAPDH基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列 Table 1 The sequences of the primers

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。以獲得的cDNA為模板，參照 EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-Low Rox試劑盒說明書建立PCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：cDNA模板2.0 μL，擴(kuò)增基因上下游引物各 0.6 μL，Evagreen 2×qPCR Master Mix 10.0 μL，RNase-free Water 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 5 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。目的基因相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組目的基因mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取使用微量分光光度計(jì)檢測樣本總RNA濃度和純度，測得A260/A280為1.8～2.0。RNA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶整齊、完整、清晰，無嚴(yán)重拖尾(圖1)，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram map of RNA agarose gel

2.2 不同毛色新疆山羊皮膚組織中MC1R、Agouti、MITF基因mRNA的表達(dá)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果表明，MC1R、Agouti及MITF基因mRNA 在不同毛色的新疆山羊皮膚組織中均有表達(dá)。MC1R基因 mRNA在黑色新疆山羊皮膚組織中表達(dá)量最高，見圖2；Agouti基因mRNA在白色新疆山羊皮膚組織中的表達(dá)量顯著高于褐色和黑色山羊(P<0.05)，褐色和黑色山羊皮膚組織中Agouti基因mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖3)；MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮膚組織中的表達(dá)量高于其他毛色(P>0.05)，見圖4。

圖2 MC1R基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的相對表達(dá)量Fig.2 The expression quantity of MC1R mRNA in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat colors

圖3 Agouti基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的相對表達(dá)量 Fig.3 The expression quantity of Agouti mRNA in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat colors

圖4 MITF基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的相對表達(dá)量Fig.4 The expression quantity of MITF mRNA in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat colors

3 討論

動物毛色主要由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的真黑素和褐黑素?cái)?shù)量和分布決定，二者不同的含量和比例形成不同的毛色[2]。

MC1R基因是控制動物毛色的重要候選基因之一，在調(diào)控黑色素合成方面發(fā)揮著重要的作用，主要在毛囊和皮膚黑色素細(xì)胞中表達(dá)[2-3]，其表達(dá)影響黑色素細(xì)胞中真黑素的形成，大量MC1R基因表達(dá)會使動物呈黑色或褐色的毛色表型[4]。在綿羊[5-6]、羊駝[7]、牦牛[8]等動物皮膚組織中發(fā)現(xiàn)，MC1R基因mRNA在深色群體皮膚組織中的表達(dá)量均高于淺色群體。李洪濤等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)MC1R基因是控制哈薩克羊被毛黑色的主效基因，哈薩克羊MC1R基因突變與黑色被毛呈極顯著相關(guān)。大量研究表明，MC1R基因與動物的毛色性狀表現(xiàn)相關(guān)。該研究結(jié)果表明，MC1R基因在黑色新疆山羊皮膚中的mRNA表達(dá)量最高，高于褐色和白色新疆山羊。這與景炅婕等[11]、蔣婧等[12]深色山羊群體皮膚組織中MC1R基因mRNA表達(dá)量高于淺色群體的研究結(jié)果相一致。

Agouti基因是調(diào)節(jié)哺乳動物毛色的基因之一，編碼信號蛋白ASIP。該信號蛋白可以降低真黑素的合成，從而促進(jìn)褐黑素的合成[13]。Agouti基因還可以通過抑制MITF的表達(dá)，降低酪氨酸酶活性，從而合成褐黑色素[14]。薛麗娜等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)Agouti基因外顯子的單核苷酸突變多態(tài)性與綿羊被毛毛色不相關(guān)，說明Agouti基因可能不是控制綿羊被毛顏色的主效基因。杜楠[17]研究表明渝東白山羊各個(gè)組織中的ASIP基因表達(dá)水平極顯著高于酉州烏羊(P<0.05)。該試驗(yàn)中白色新疆山羊Agouti基因的mRNA表達(dá)水平最高，顯著高于褐色和黑色新疆山羊(P<0.05)，說明Agouti基因在新疆山羊毛色形成過程中發(fā)揮作用，但是否為控制新疆山羊毛色的主效基因還有待深入研究。

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)是色素細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的信號分子，通過調(diào)控酪氨酸基因家族的表達(dá)參與黑色素的合成[18]。劉錚錚[19]研究表明，人類MITF基因突變引起 Waardenburg 綜合征 2A 型(WS2A)，典型癥狀表現(xiàn)為先天性白內(nèi)障和神經(jīng)性耳聾。張建一[20]研究發(fā)現(xiàn)黑色牦牛皮膚中MITF基因mRNA相對表達(dá)量顯著高于白色牦牛，說明牦牛白色被毛和黑色被毛性狀可能與MITF基因在皮膚組織中mRNA的表達(dá)量有關(guān)。該試驗(yàn)中MITF基因 mRNA 在黑色新疆山羊皮膚中的表達(dá)量高于褐色和白色山羊，說明在一定程度上MITF基因可能參與了新疆山羊毛色的形成。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，MC1R、Agouti和MITF基因在不同毛色新疆山羊皮膚組織中均有表達(dá)。MC1R、MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮膚組織中的表達(dá)量最高，其在白色新疆山羊皮膚組織中的表達(dá)量最低；不同毛色新疆山羊皮膚組織中Agouti基因mRNA的表達(dá)量高低順序?yàn)榘咨?褐色>黑色。以上結(jié)果表明毛色候選基因MC1R、Agouti和MITF基因在一定程度上參與了新疆山羊黑色素生成和沉積。由于毛色是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，毛色基因MC1R、Agouti和MITF與新疆山羊毛色的相關(guān)性還有待進(jìn)一步探究。