高繼緒,張修華

(臨沂市腫瘤醫(yī)院,山東 臨沂 276000)

有文獻(xiàn)報(bào)道,T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)是大多數(shù)免疫細(xì)胞表面表達(dá)的抑制分子,半乳凝素-9是其配體,兩者結(jié)合后可以抑制免疫應(yīng)答,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[1]。本研究通過(guò)檢測(cè)肺癌患者Tim-3 的表達(dá),分析其與臨床相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系,探討是否可作為肺癌患者特異分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年6月—2023年1月本院收治的56例肺癌患者(病例組)。納入標(biāo)準(zhǔn):均經(jīng)臨床病理確診;均行手術(shù)治療;簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前接受放化療及生物治療等;伴有其他惡性腫瘤、呼吸和血液系統(tǒng)以及自身免疫疾病;肝腎和心臟等臟器嚴(yán)重功能障礙。56 例患者中,男34例,女22例;年齡43～69歲,平均(56.21±11.52)歲;導(dǎo)管癌22例,腺癌26例,腺鱗癌8例。以同期在該院體檢的30例健康者為對(duì)照組,其中男19例,女11例;年齡42～70歲,平均(55.86±10.73)歲。兩組一般資料比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 試劑和儀器 人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)科學(xué)院天津試劑廠),Trizol(Invitrogen公司),Tim-3試劑(日本Ta KaRa公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(廈門(mén)科華生物工程公司),全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀及原裝試劑(美國(guó)羅氏診斷公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集和處理 EDTAK2抗凝管采集空腹全血3 m L,用淋巴細(xì)胞分離液分出單個(gè)核細(xì)胞后立即按照TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。

1.3.2 Tim-3 實(shí)時(shí)定量檢測(cè) 按試劑說(shuō)明書(shū)把RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37℃、60 min,95℃加熱5 min滅活酶。引物序列及產(chǎn)物大小:Tim-3F:CCCAAGCTTCCACCATGTTTTCACATCTTCC,Tim-3R:TATGCGGCCGCCTATGGCATTGCAAAGCGAC, 906 bp; B-actin F:GGCATCGTGATGGACTCCG,B-actin R:GCTGGAAGGTGGACAGCGA,613 bP。熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為40μL,反應(yīng)體系含DDW1 0.5μL,Taq Mix 12.5μL,Tim-3F 0.5μL,Tim-3R 0.5μL,cDNA 5μL,1μL 滅菌水。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5 min后,進(jìn)行下述循環(huán):95℃、45 s,56℃退火45 s,72℃延伸92 s,32個(gè)循環(huán)。結(jié)果判讀:每次擴(kuò)增設(shè)置陰性和內(nèi)參對(duì)照,陰性對(duì)照用滅菌蒸餾水,樣本設(shè)三個(gè)復(fù)孔,取Ct平均值,所有擴(kuò)增產(chǎn)物均經(jīng)溶解曲線分析,采用比較2-△Ct法進(jìn)行Tim-3的相對(duì)定量。

1.3.3 CEA 的測(cè)定 抽取2 m L 空腹靜脈血,分離血漿,采用羅氏E601及配套試劑盒檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩組Tim-3m RNA 表達(dá)水平的比較 病例組術(shù)前Tim-3 m RNA 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(t=9.78,P＜0.01),術(shù)后與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.49,P=0.141)。不同類(lèi)型肺癌術(shù)前及術(shù)后比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.32,0.61;P＞0.05)。

表1 兩組Tim-3 m RNA 表達(dá)水平的比較(±s)

組別類(lèi)型n術(shù)前術(shù)后病例組56 0.94±0.34 0.41±0.32導(dǎo)管癌 22 0.87±0.30 0.37±0.26腺 癌 26 1.03±0.38 0.46±0.37腺鱗癌 8 0.92±0.34 0.35±0.33對(duì)照組30 0.31±0.25

2.2 病例組PBMCs中Tim3 m RNA 的表達(dá)水平與CEA 的相關(guān)性分析Tim-3mRNA 與肺癌輔助診斷指標(biāo)CEA 呈顯著正相關(guān)(r=0.30,P＜0.01)。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn),Tim-3可與其配體半乳糖凝集素-9結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17及其他多種免疫細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)控因子[2]。Tim-3在口腔癌、腎癌、肝癌、肺癌、結(jié)直腸腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)[3-6];TIM-3也在單核-巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)[7];Tim-3還通過(guò)提高調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞擴(kuò)增、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞活化而產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸[8]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)了肺癌患者術(shù)前、綜合治療后及健康對(duì)照組PBMCs中Tim-3的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-3在肺癌患者外周血中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,術(shù)后綜合治療后與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且肺癌患者Tim-3的表達(dá)量與病理類(lèi)型無(wú)關(guān)。其可能機(jī)制在于Tim-3在抗腫瘤的免疫過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸,有利于腫瘤在原位點(diǎn)向組織深層侵襲[9]。本研究還發(fā)現(xiàn),肺癌患者PBMCs中Tim-3的相對(duì)表達(dá)量與其血漿CEA 的濃度顯著正相關(guān)。肺癌患者綜合治療后Tim-3含量顯著下降,提示Tim-3對(duì)肺癌的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮作用,對(duì)肺癌患者實(shí)行治療能解除Tim-3的腫瘤免疫負(fù)調(diào)控,改善預(yù)后。

綜上所述,Tim-3可作為監(jiān)測(cè)肺癌患者治療或預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物,幫助臨床評(píng)估肺癌患者。本研究不足之處在于實(shí)驗(yàn)對(duì)象較少,缺少隨訪數(shù)據(jù),后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。