張?zhí)m蘭，李才華，方雨竹，宋巖，康婉琳，李志宇，張曉 ，張銳

1.長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR），又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）或短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR），是由1~6 bp短核苷酸為基本重復(fù)單位首尾相連而成。SSR 分布于基因組中，某些具有特異性的重復(fù)序列可作為物種鑒定的分子依據(jù)。SSR 既存在于細(xì)胞核基因組中，也存在于葉綠體和線粒體基因組中。其中，線粒體SSR（mtSSR）由Soranzo［1］于1999 年最先提出，并在松科植物中篩選出了第一批mtSSR引物。

SSR 分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、分布廣泛、共顯性等特點(diǎn)，同時(shí)，線粒體基因組結(jié)構(gòu)上具有進(jìn)化速率快、母系遺傳等特點(diǎn)。因此，植物mtSSR分子標(biāo)記在物種鑒定、分子育種、基因流動(dòng)進(jìn)化、物種演化、胞質(zhì)遺傳特性、種群分類等方面具有重要應(yīng)用。

1 植物線粒體基因組的特點(diǎn)

目前，GenBank 共收錄了532 種植物線粒體基因組全序列。其中最小的為95 884 bp（Gayralia brasiliensis），最大的為4 008 762 bp（Larix sibirica）。植物線粒體基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多數(shù)為環(huán)狀或多元環(huán)狀雙鏈DNA，少數(shù)以線性DNA 分子存在［2］。植物線粒體基因組中含有大量的重復(fù)序列，其在基因編碼序列上進(jìn)化非常緩慢，但基因間隔區(qū)的重排或重組卻很活躍，且重復(fù)序列的長(zhǎng)短與重組頻率基本呈正相關(guān)［3-4］。同時(shí)，植物線粒體基因組中也可含有來(lái)自細(xì)胞核和葉綠體基因組的序列，即存在DNA 在細(xì)胞內(nèi)的水平基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）現(xiàn)象［5］，例如，擬南芥線粒體基因組中4%的序列來(lái)自于細(xì)胞核、1%的序列來(lái)自于葉綠體［6］。根據(jù)剪接機(jī)制和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分，植物線粒體基因組中還存在Ⅰ類和Ⅱ類內(nèi)含子。細(xì)胞器內(nèi)含子的獲得和丟失以及內(nèi)含子的流動(dòng)性對(duì)線粒體DNA 的大小、變異和重排有一定的促進(jìn)作用，有利于線粒體基因組的進(jìn)化［7］。此外，植物線粒體基因組中還存在RNA 編輯現(xiàn)象［8］。

2 植物mtSSR研究進(jìn)展

2.1 植物mtSSR特點(diǎn)

銀杏［9］、紅皮柳［10］、煙草［11］、雷蒙德氏棉［12］的mtDNA 大小分別是：346 595、598 970、430 597、676 078 bp，從中分別發(fā)現(xiàn)了240、404、578、674 個(gè)mtSSR。用MISA 軟件對(duì)這4 種植物的mtSSR 進(jìn)行分析，當(dāng)1~6 核苷酸重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)分別設(shè)置為8、4、4、3、3、3時(shí)，從銀杏、紅皮柳、煙草、雷蒙德氏棉中分別檢測(cè)到（159、0、12、60、1、8）、（171、157、17、49、9、1）、（31、392、136、2、3、14）、（300、240、23、97、12、2）個(gè)SSR。單核苷酸重復(fù)中，A/T占比在紅皮柳、煙草、雷蒙德氏棉中分別為90.7%、93.55%、90.67%，但銀杏中A/T 只占10.69%。煙草線粒體基因組mtSSR 中，二堿基重復(fù)基序出現(xiàn)最多的是AT/TA和AC/TG，分別占二堿基重復(fù)基序的41.33%和40.31%；三堿基重復(fù)基序以AAT/TTA 最多，占37.5%；四、五、六堿基重復(fù)基序的類型多且分散，但出現(xiàn)次數(shù)少。SSR 間的平均距離是745 bp。雷蒙德氏棉mtDNA 中含有12 種五核苷酸重復(fù)和2種六核苷酸重復(fù)，其中只有1 種定位于編碼區(qū)（matR），2 種定位于內(nèi)含子區(qū)（nad4-內(nèi)含子3×2），其余均位于基因間隔區(qū)。Kuntal等［13］對(duì)不同植物類群mtSSR模式的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。Ishii 等［14］根據(jù)小麥的mtDNA 全序列，鑒定出21 個(gè)具有10 個(gè)以上單核苷酸重復(fù)序列的mtSSR 位點(diǎn)，其中有15 個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)多態(tài)性帶型。比較發(fā)現(xiàn)，mtSSR 在等位基因數(shù)、多樣性值等方面的變異性遠(yuǎn)小于葉綠體SSR。Nishikawa 等［15］對(duì)水稻mtDNA 中的SSR 及其側(cè)翼區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多處堿基替換和缺失/插入，在單核苷酸SSR 中G（或C）重復(fù)序列比A（或T）重復(fù)序列更易變異。此外，Jaramillo-Correa 等［16］比較了冷杉屬中富含STR 的線粒體位點(diǎn)（nad5-4內(nèi)含子）與缺乏STR 的線粒體位點(diǎn)（共11 個(gè)）的DNA 變異情況，分析了STR 的重復(fù)積累與mtDNA 特定區(qū)域突變率增加之間的關(guān)系，結(jié)果表明重復(fù)序列在植物mtDNA中具有誘發(fā)DNA序列變異的作用。

2.2 植物mtSSR在群落分析中的應(yīng)用

1999 年，Soranzo 等［1］首次在針葉松mtDNA 的nad3和rps12間的基因間隔區(qū)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)序列（G）n，該序列在15種松樹(shù)屬植物中表現(xiàn)出3種不同形態(tài)。Tollefsrud 等［17］對(duì)挪威云杉線粒體nad1基因的2 個(gè)小衛(wèi)星區(qū)域進(jìn)行了變異評(píng)估，結(jié)果鑒定出28 個(gè)線粒體變體；進(jìn)一步對(duì)挪威云杉北歐譜系的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在北歐挪威云杉最古老的地區(qū)，微衛(wèi)星多樣性較高，且核微衛(wèi)星和線粒體微衛(wèi)星之間具有整體一致性［18］。Sperisen 等［19］發(fā)現(xiàn)挪威云杉nad1基因第2 內(nèi)含子的2 個(gè)多態(tài)性線粒體串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記，其大小變異表現(xiàn)出明顯的種群分化和地理分布。Godbout等［20］利用母系遺傳的mtSSR，對(duì)自然分布范圍內(nèi)91 個(gè)黑松種群的單倍型多樣性進(jìn)行研究，確定了種群結(jié)構(gòu)中冰川生態(tài)變化的遺跡特征，表明夏洛特皇后群島和亞歷山大群島在太平洋西北地區(qū)具有為一些物種提供避難所的作用。Semerikov等［21］鑒定出一個(gè)線粒體小衛(wèi)星位點(diǎn)，該位點(diǎn)在歐洲、西伯利亞、蒙古的歐洲赤松中含有41 個(gè)等位基因；同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)首次對(duì)西伯利亞落葉松4 個(gè)線粒體SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性進(jìn)行了大范圍調(diào)查［22］，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)西伯利亞西部平原落葉松種群可能起源于薩彥山脈的山麓丘陵。Aizawa等［23］使用6 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)和母系遺傳的線粒體基因序列，研究了庫(kù)頁(yè)云杉在自然環(huán)境中的遺傳結(jié)構(gòu)，在庫(kù)葉云杉和條斑云杉中新發(fā)現(xiàn)了一些小衛(wèi)星基序和可變位點(diǎn)。

除了松杉類植物，mtSSR在其他植物群落分析中也有應(yīng)用。例如，Hosaka 等［24］在馬鈴薯mtDNA中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SSR標(biāo)記，顯示40條帶型，可區(qū)分63種不同的mtDNA。Villarreal等［25］通過(guò)富集文庫(kù)法和454鳥(niǎo)槍測(cè)序法進(jìn)行微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)，共設(shè)計(jì)9對(duì)引物，對(duì)89 份阿巴拉契亞南部角苔種質(zhì)、9 份墨西哥角苔種質(zhì)和16 份Nothoceros vincentianus種質(zhì)進(jìn)行了測(cè)試，分別獲得了線粒體基因座和6個(gè)基因座，其中3 個(gè)來(lái)自葉綠體，3 個(gè)來(lái)自細(xì)胞核。此外，開(kāi)發(fā)出新的微衛(wèi)星引物，用于檢測(cè)大角苔內(nèi)及其他角苔物種的遺傳分化，以及研究阿巴拉契亞山脈南部具有特殊性別異域性的分類群中遺傳變異的劃分。例如，張先啟等［26］利用2 對(duì)具有多態(tài)性條帶的線粒體SSR 引物對(duì)76 個(gè)板栗品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，在2個(gè)多態(tài)性SSR 位點(diǎn)檢測(cè)到4個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生2個(gè)等位基因。

2.3 植物mtSSR在鑒定胞質(zhì)類型中的應(yīng)用

mtSSR 在鑒定胞質(zhì)類型中主要用于禾本科植物及煙草、棉花等植物。Rajendrakumar 等［27］發(fā)現(xiàn)在水稻線粒體基因組nad5基因上游，存在一段AT重復(fù)序列，該序列在CMS系中是（AT）6或（AT）14，而在保持系中是（AT）11。根據(jù)該位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記（drrcms）不僅可以用來(lái)鑒別野敗水稻不育系和保持系，而且可以鑒別另外2 種CMS 系：DMS3A（來(lái)源于Oryza nivaraS.D. Sharma and Shastry 胞質(zhì)）和DMS4A（來(lái)源于OryzarufipogonGriff.胞質(zhì)）。Wang 等［28］利用21 對(duì)來(lái)自甘藍(lán)型油菜mtDNA 序列的SSR 引物，研究了甘藍(lán)型油菜6 種不同CMS 類型的SSR 圖譜，共有4 對(duì)mtSSR 引物在6 個(gè)甘藍(lán)CMS 系中顯示多態(tài)性，其中多態(tài)性主要包括SSR 數(shù)目變異、SNP 和序列插入或缺失。Zhang 等［29］在鑒定陸地棉CMS 系P30A 及其保持系P30B mtDNA 差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)完整atpA基因終止密碼子下游160 bp 處存在一個(gè)SSR 位點(diǎn)（SSR160），該位點(diǎn)在P30B、P30A、CMS-D2、CMS-D8中的序列分別是（TAA）7（TA）6、（TAA）3（TA）2、（TAA）3（TA）2、（TAA）4（TA）3；進(jìn)一步在棉屬中篩查該位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)可將34種棉花分成17種不同的類型［30］。李鳳霞等［31］利用mtSSR分子標(biāo)記成功鑒別煙 草Nta（sua.）S、Nta（gla.）S、Nta（rep.）S 和Nta（rus.）S等4種不同CMS系。

2.4 植物mtSSR數(shù)據(jù)庫(kù)

目前，線粒體SSR數(shù)據(jù)庫(kù)有ChloroMitoSSRDB、植物線粒體SSR 庫(kù)（MitoSatPlant）、微衛(wèi)星查找器（micro satellite identification took，MISA）、多態(tài)性微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)（pSATdb）、蠶豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（vicia faba omics database，VfODB）、菠 蘿SSR 數(shù) 據(jù) 庫(kù)PineElm_SSRdb、微 衛(wèi) 星 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（microSatellite database，MSDB）、SSRome等（表1）。

ChloroMitoSSRDB［32］是一個(gè)完整的面向Web的數(shù)據(jù)庫(kù)，包含細(xì)胞器基因組中的完美重復(fù)和不完美重復(fù)。數(shù)據(jù)庫(kù)包含1 982 個(gè)mtDNA 的完美和不完美SSR。這些重復(fù)進(jìn)一步超鏈接到帶注釋的基因區(qū)域（編碼或非編碼），并鏈接到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（www.ncbi.nlm.nih.gov/）的相應(yīng)基因記錄，以識(shí)別和理解重復(fù)區(qū)域的位置關(guān)系。它提供與重復(fù)位置（編碼和非編碼）、重復(fù)大小、基序和長(zhǎng)度多態(tài)性等相關(guān)的有用信息，用于開(kāi)發(fā)分子系統(tǒng)發(fā)育的功能性標(biāo)記，估計(jì)物種間的分子變異等。升級(jí)版ChloroMitoSSRDB 2.00［33］數(shù)據(jù)庫(kù)提供了總共4 454 個(gè)細(xì)胞器基因組的訪問(wèn)，顯示了共40 653 個(gè)IMEx 完美SSR（11 802 個(gè)葉綠體完美SSR 和28 851 個(gè) 線 粒 體 完 美SSR），275 981 個(gè)IMEx 不完美SSR（78 972 個(gè)葉綠體不完美SSR 和197 009個(gè)線粒體不完美SSR），35 250個(gè)MISA（微衛(wèi)星識(shí)別工具）完善的SSR 和3 211 個(gè)MISA 復(fù)合SSR 以及相關(guān)信息。此外，ChloroMitoSSRDB 2.00利用門戶網(wǎng)站集成并提供了可利用的SSRs分析挖掘工具，用于組裝的細(xì)胞器基因組和下一代測(cè)序讀取，允許用戶使用2種重復(fù)算法執(zhí)行多個(gè)SSR搜索和瀏覽。

植物線粒體SSR 庫(kù)（MitoSatPlant［34］）包含從92個(gè)綠色植物mtDNA 中提取的完美、不完美和復(fù)合SSR信息，共發(fā)現(xiàn)72 798條SSR，其中PCR引物設(shè)計(jì)用于72 495條SSR。MitoSatPlant使用SQL 2008服務(wù)器開(kāi)發(fā)，可以通過(guò)ASP設(shè)計(jì)的前端進(jìn)行訪問(wèn)。

MISA 是一種在核苷酸序列中查找微衛(wèi)星序列的工具，除了檢測(cè)完整的微衛(wèi)星序列外，MISA還能夠找到由多個(gè)簡(jiǎn)單序列基序組成的完美復(fù)合微衛(wèi)星序列。Beier 等［35］擴(kuò)展了MISA，并將其重新實(shí)現(xiàn)為基于Web 的應(yīng)用程序，改進(jìn)了復(fù)合微衛(wèi)星檢測(cè)，并增加了以GFF3 格式顯示和導(dǎo)出MISA結(jié)果用于下游分析的可能性。

為了探索屬間的種間差異，Kumar 等［36］開(kāi)發(fā)出一種多態(tài)性微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)——pSATdb（https：//lms.snu.edu.in/pSATdb/）。pSATdb 包含28 710 個(gè)微衛(wèi)星，對(duì)后生動(dòng)物（metazoa）和綠色植物（viridiplantae）中1 576 個(gè)屬的5 976 個(gè)mtDNA 序列進(jìn)行了鑒定，其中后生動(dòng)物和綠色植物分別有1 535個(gè)（5 846 個(gè)mtDNA）和41 個(gè)（130 個(gè)mtDNA）屬。pSATdb 是唯一一個(gè)提供mtSSR 長(zhǎng)度變異屬信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。由于微衛(wèi)星在基因組學(xué)研究中的新型作用，儲(chǔ)存在pSATdb 中已被識(shí)別的常見(jiàn)、多態(tài)和獨(dú)特微衛(wèi)星將有效地用于各種研究，包括遺傳多樣性、遺傳圖譜的繪制、標(biāo)記輔助選擇和比較群體研究。

蠶豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（VfODB）是一種綜合了種質(zhì)信息、表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）、表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）和線粒體SSR、microRNA 目標(biāo)標(biāo)記和蠶豆遺傳圖譜的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)［37］?；趍tDNA 挖掘，VfODB 數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)了40 個(gè)mtSSR 分子標(biāo)記。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)整理，可以檢索到3 461 個(gè)標(biāo)記，代表12 種類型（CAPS、EST、EST-SSR、基因標(biāo)記、INDEL、同工酶、ISSR、RAPD、SCAR、RGA、SNP 和SSR）。VfODB 還提供2 種用戶友好的工具來(lái)識(shí)別、分類SSR基序，并在計(jì)算機(jī)分析中擴(kuò)增其目標(biāo)。

Chaudhary 等［38］嘗試從菠蘿基因組、葉綠體、線粒體和EST 序列中鑒定SSR。在菠蘿中共鑒定出359 511 個(gè)SSR（基因組序列356 385 個(gè)，葉綠體序列45個(gè)，線粒體序列249個(gè)，EST序列2 832個(gè)），建立了一個(gè)開(kāi)源數(shù)據(jù)庫(kù)PineElm_SSRdb，該數(shù)據(jù)庫(kù)將為在菠蘿領(lǐng)域工作的育種家以及其他研究標(biāo)記的跨物種轉(zhuǎn)移性、多樣性調(diào)查、作圖和DNA 指紋的研究人員提供方便。

微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)（MSDB）提供了37 680 個(gè)基因組中超過(guò)40 億個(gè)微衛(wèi)星的集合，用于簡(jiǎn)化、交互式分析和可視化，是迄今為止訪問(wèn)和分析多物種微衛(wèi)星數(shù)據(jù)最全面、最具注釋性和最新的數(shù)據(jù)庫(kù)［39］。MSDB 使用戶能夠以表格的形式瀏覽數(shù)據(jù)，表格可以過(guò)濾和導(dǎo)出，還可以作為交互式圖表，同時(shí)查看和比較多個(gè)物種的數(shù)據(jù)。

SSRome 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)、用戶友好、全面和動(dòng)態(tài)的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于探索6 533種生物中的微衛(wèi)星［40］。在SSRome 中，除了所有線粒體和葉綠體基因組以及NCBI提供的表達(dá)序列標(biāo)簽外，在所有分類群中還發(fā)現(xiàn)了1.58億個(gè)微衛(wèi)星基序。此外，該數(shù)據(jù)庫(kù)還開(kāi)發(fā)了4 510 萬(wàn)個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，并分類為基因型或非基因型。SSRome 可在基因組或轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)識(shí)別、分類和比較基序。

3 展望

植物mtSSR 兼具SSR 多態(tài)性高、植物mtDNA母系遺傳和結(jié)構(gòu)變化快等優(yōu)點(diǎn)，目前已在植物群落分析和胞質(zhì)類型鑒定等方面獲得了較為廣泛的應(yīng)用。之前mtSSR 的開(kāi)發(fā)效率較低，但隨著DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的植物mtDNA 完成全測(cè)序，mtSSR 的特征將更清晰地顯示出來(lái)。相信mtSSR 在植物指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、分子輔助育種、遺傳多樣性分析以及品種純度鑒定等方面也將獲得越來(lái)越多的應(yīng)用。