動物源性食品中喹諾酮藥物的前處理提取優(yōu)化研究

◎廖祺予

（四川省中安檢測有限公司，四川 成都 610100）

獸藥（Veterinary Drugs，VD）在獸醫(yī)業(yè)中廣泛應(yīng)用于疾病治療和預(yù)防，也可以用來提升養(yǎng)殖的效率。如果獸藥使用不當，可能導致供人食用的動物源性食品中存在獸藥殘留，從而造成健康風險[1-2]。長期暴露在這種環(huán)境下，即使獸藥殘留的濃度很低，人群耐藥性也可能會提高，造成不良的影響。喹諾酮類藥物是一種抗微生物類的藥物，典型代表有諾氟沙星、丹諾沙星、氧氟沙星[3]，隨著各項技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新的喹諾酮藥物的合成以及相應(yīng)的檢測方法相繼問世。高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）以其液相強大的分離功能和質(zhì)譜強大的檢測功能等其他獨特的優(yōu)勢，在檢測分析領(lǐng)域深受喜愛并廣泛應(yīng)用，成為了國內(nèi)外最常用的定量定性儀器[4]。

1 儀器設(shè)備試劑及標準物質(zhì)

1.1 儀器設(shè)備

儀器型號廠家見表1。

表1 儀器型號廠家表

1.2 試劑

1.2.1 試劑信息

試劑純度廠家見表2。

表2 試劑純度廠家表

1.2.2 試劑的配置

（1）1%酸化乙腈：用10 mL 量筒量取0.01 L 甲酸，用玻璃棒轉(zhuǎn)移至1 L 的容量瓶內(nèi)，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內(nèi)，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效使用期限30 d。

（2）20%甲醇水：用200 mL 量筒量取0.2 L 甲醇，用玻璃棒轉(zhuǎn)移至1 L 的容量瓶內(nèi)，再用超純水清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內(nèi)，最后再用超純水定容至容量瓶的刻度線，搖勻，有效使用期限30 d。

（3）0.1%甲酸：用1 mL 移液槍移取0.001 L 甲酸，轉(zhuǎn)移至1 L 的容量瓶內(nèi)，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效期30 d。

（4）10%酸化乙腈：用100 mL量筒量取0.1 L甲酸，用玻璃棒轉(zhuǎn)移至1 L 的容量瓶內(nèi)，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內(nèi)，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效期30 d。

（5）5%酸化乙腈：用100 mL 量筒取0.05 L 甲酸，用玻璃棒轉(zhuǎn)移到1 L 的容量瓶里，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內(nèi)，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效期30 d。

2 實驗步驟

2.1 提取

本方法適用于動物蛋類，魚類，肌肉組織等動物源性食品中洛美沙星、恩諾沙星、單諾沙星等8 種喹諾酮類獸藥殘留量的測定。樣品利用酸化乙腈提取試樣中喹諾酮類化合物，利用凈化劑去除試樣中的油脂、水分、有機酸等，經(jīng)LC-MS 測定，采用內(nèi)標法定量[5]。

準確稱取5 g 左右樣品（精確到0.002 g）于50 mL 具塞離心管中，加入沙星類內(nèi)標物標準工作液，加標樣品進行加標。加入20 mL 1%的甲酸乙腈，均質(zhì)1 min 再用渦旋儀進行混勻，超聲提取30 min，4 000 r/min 離心5 min 再加入20 mL 1%甲酸乙腈第2 次重復(fù)提取，將2 次提取液合在一起，待凈化。

2.2 凈化

將合并后的提取液轉(zhuǎn)移到125 mL 分液漏斗中，于分層后的上清液中加入25 mL 正己烷（乙腈飽和），振蕩搖勻2 min，收集下層的乙腈溶液，舍棄上層的正己烷溶液，于40 ℃左右的旋蒸裝置中濃縮至近干，最后用高純度氮氣吹干。

2.3 溶劑置換

加入1 mL 20%甲醇-水溶解，在渦旋儀上混勻30 s，定容液過0.22 μm 的綠色有機濾膜，除去顆粒物等雜質(zhì)后供LC-MS 上機測定。

2.4 儀器參考條件

2.4.1 液相色譜參考條件

進樣量為2μL，色譜柱為碳十八柱，色譜柱規(guī)格為1.8 μm 3.0 mm×50 mm，柱溫箱的溫度恒定為35 ℃，流速為0.3 mL/min，流動相為0.1%甲酸水和CH3OH，洗脫條件為梯度洗脫，詳情見表3。

表3 液相洗脫條件表

2.4.2 質(zhì)譜參考條件

離子源溫度為350 ℃，MS 四級桿溫度為100 ℃，掃描方式為正離子，采集類型為全掃描模式掃描，電離方式為大氣壓電噴霧離子源，簡稱ESI 源。質(zhì)譜采集條件見表4。

表4 質(zhì)譜采集條件表

2.5 提取液的選擇

GB/T 20366-2006采用的提取液為2%的甲酸乙腈，但通過實驗發(fā)現(xiàn)，提取效果不佳，不能使8 種沙星的回收率同時保證在一個優(yōu)良的條件下。據(jù)了解，川內(nèi)實驗室多采用1%的甲酸乙腈進行提取，通過大量的實驗數(shù)據(jù)證明甲酸濃度在1%時，回收率是最為優(yōu)良的，最終確定8 種沙星的提取液為1%的加甲酸乙腈。

通過對動物蛋類、魚類、肌肉組織3 種基質(zhì)分別進行4 個梯度的實驗（甲酸濃度0%、1%、5%、10%），每個梯度進行3 平行試驗，RSD 在10%以內(nèi)。得到加標回收率平均值，空白試驗無值，樣品本底無值，動物源性樣品在質(zhì)譜普遍存在電荷競爭現(xiàn)象，會造成回收率的影響，但已經(jīng)在GB/T 21312-2007 和GB/T 20366-2006 所規(guī)定的范圍（80%～120%），綜上，考慮使用回收率較為優(yōu)良的1%的甲酸乙腈。

2.6 凈化方式的選擇

GB/T 21312-2007 采用的是固相萃取，固相萃?。⊿PE）的工作有2 種方式，第1 種就是通過吸附提取目標物，第2 種則是通過吸附生物雜質(zhì)，固相生物萃取方法是基于化學色譜方法原理而發(fā)展起來的一項技術(shù)，樣品通過外界吹動裝置的正壓或者真空裝置的負壓或者兩者的聯(lián)合作用而通過SPE 小柱。由于不同固體上的吸附黏合劑可能會產(chǎn)生具有不同的有機官能基團，可以將特定的有機化合物固體吸附并將其保留在SPE 的圓柱上但該方法耗時長，操作煩瑣，且動物源性食品中的油脂等基質(zhì)會堵塞SPE小柱，導致淋洗洗脫的困難，更為嚴重者則根本無法進行淋洗洗脫[5]。

QuEChERS（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe），是一種近幾年新發(fā)展起來比較熱門的一種凈化基質(zhì)的構(gòu)象與操作。但該方法中所使用的C18 雖然對動物源性食品中的油脂有很好的除雜功能，但同時通過大量實驗發(fā)現(xiàn)C18 會對目標物也造成影響，從而造成回收率的下降，達不到標準。

綜上，選擇了GB/T 20366-2006 中用正己烷來去除油脂等會造成基質(zhì)抑制的雜質(zhì)的方法，正己烷與油脂的極性相似，根據(jù)相似相溶原理，油脂會溶解在正己烷中，同時由于正己烷與乙腈的極性相差較大，不會相容，正己烷密度比乙腈小，所以說分層后正己烷層會在上層，乙腈層會在下層，這種方法既方便快捷，而且凈化的效果也好，回收率也保持在了一個優(yōu)良的水平。

3 實驗驗證

3.1 線性范圍，相關(guān)系數(shù)，檢出限

根據(jù)線性范圍、檢出限分別配制濃度為0.5、1、2、4、8、16 μg/L 的6 個級別的標液。以儀器響應(yīng)值為豎軸，濃度（μg/L）為橫軸。根據(jù)規(guī)定以10 倍信噪比（S/N=10）為檢出限，喹諾酮藥物的檢出限為0.5 ng/kg。對 比GB/T 21312-2007，1 ng/kg 的檢出限，該方法的檢出限更低，檢測更靈敏，滿足國家檢測要求。

3.2 精密度和回收率的檢測

回收率和精密度實驗以加標回收率為驗證標準，在食品中選取不含喹諾酮藥物的動物肌肉組織、魚肉、蛋類基質(zhì)進行加標回收率驗證。根據(jù)國家標準GB/T 27404-2008中的相關(guān)規(guī)定選取1倍定量限1.5 μg/L、2 倍定量限3 μg/L、10 倍定量限15 μg/L 為該方法驗證的3 個加標水平用對樣品進行加標。進行3 個水平，每個水平六平行的回收率驗證實驗，按照前面所述的前處理方法進行實驗。實驗結(jié)果表明在不同的基質(zhì)影響下加標回收和RSD 都保持在了一個良好的水平，且完全符合GB/T 27404-2008。

3.3 準確度實驗

用本方法測定有真值的質(zhì)控樣品。平行測定 6次。測定值與真值見表5。各項測定結(jié)果都滿足GB/T 27404-2008 中各項相關(guān)規(guī)定，能夠很好地對待測樣品中的喹諾酮類藥物進行準確定量分析。

表5 測定值與真值表

4 結(jié)語

該方法改進了提取液中甲酸的濃度，通過對比各種酸度下乙腈的提取效果來選擇最優(yōu)方案，提取效果用回收率表示，回收率為不同濃度下液相質(zhì)譜串聯(lián)儀上的檢測結(jié)果濃度和加入濃度計算所得，根據(jù)結(jié)果顯示改進后的方法對于動物肌肉組織、魚類、蛋類有良好的檢測效果。在保持較好的靈敏度，準確度和精確度下，仍然能夠保持較好的回收率。并且前處理的方法比其他方法簡單快捷，適用的基質(zhì)種類范圍也比較廣，在面對大批量的樣品時，能夠很好地節(jié)省人力和物力，提高檢測的效率。