天麻洋參含片中天麻素和人參總皂苷的含量測(cè)定

◎楊 芳，龍澤霞，盧文艷，劉 穎，朱軍君

（1.常德市食品檢驗(yàn)所，湖南 常德 415000；2.湖南德海制藥有限公司，湖南 常德 415000）

天麻洋參含片是一種保健食品，主要成分為天麻、西洋參等，經(jīng)粉碎、滅菌、混合、制粒、干燥、壓片等工序制成片劑。按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》開展功能學(xué)評(píng)價(jià)表明，天麻洋參含片具有明顯的延緩衰老功能[1-2]。目前保健食品相關(guān)的技術(shù)規(guī)范尚未制定天麻素及人參總皂苷含量測(cè)定方法，為提高產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平，確保產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。本文參照中國藥典及其他文獻(xiàn)[3-6]的方法測(cè)定，對(duì)天麻洋參含片的主要活性成分天麻素及人參總皂苷進(jìn)行研究，分別建立了高效液相色譜法測(cè)定天麻洋參含片中天麻素含量和紫外-可見分光光度法天麻洋參含片中人參總皂苷含量。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 試樣

天麻洋參含片（批號(hào)：20200909、20200915、20201022）、陰性試樣（包括不含天麻陰性試樣、不含西洋參陰性試樣）均由湖南德海制藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

天麻素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110807-202010，含量：95.5%）；人參皂苷Re（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110754-201826，含量：97.4%）。

1.1.3 試劑

水為一級(jí)水；乙腈：色譜純，除非另有說明，本方法使用試劑均為分析純（如:無水乙醇、氯仿、磷酸、高氯酸、香草醛、冰乙酸、乙醇等）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀配DAD 檢測(cè)器（安捷倫，1260型）、色譜柱（ULtimate AQ-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）、雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析，UV-1900）、分析天平（精度為0.000 1 g）、KQ2200E型超聲波發(fā)生器、超純水儀、渦旋振蕩器。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻素的含量測(cè)定

2.1.1 實(shí)驗(yàn)溶液的制備方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。精密稱定天麻素10.0mg（精度0.000 1 g），于50 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，混勻，即得0.191 mg/mL天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液[6-7]。

（2）試樣溶液的制備。取本品20 片，于研缽中研成細(xì)粉，精密稱定細(xì)粉1.0 g（精度0.000 1 g）試樣置于具塞錐形瓶中，加甲醇15 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min[8]，將甲醇液轉(zhuǎn)移至30 mL容量瓶中，于殘?jiān)屑蛹状?5 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min[8]，將甲醇液轉(zhuǎn)移至30 mL 容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，混勻，過濾，取上清液5 mL，蒸干，加流動(dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用流動(dòng)相定容至刻度，混勻，即得試樣溶液，取適量上清液過0.22 μm 濾膜，待液相色譜測(cè)定。

（3）不含天麻陰性試樣溶液的制備。取天麻陰性試樣，按步驟（2）試樣溶液配制方法制成不含天麻陰性試樣溶液。

2.1.2 儀器參考條件

色譜柱：C18柱；以甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.1 moL/L 的磷酸二氫鉀溶液和0.1 moL/L 的磷酸二氫鈉溶液等量混合）一水（3.0：4.5：92.5）為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量是10 μL。

（1）檢測(cè)波長(zhǎng)確定。取天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在DAD檢測(cè)器下掃描，結(jié)果天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液在219.61 nm 處有最大吸收[10]，故將220 nm 定位本品的檢測(cè)波長(zhǎng)，具體如圖1 所示。

圖1 DAD 檢測(cè)器波長(zhǎng)掃描圖

（2）流動(dòng)相確定。分別選用了乙腈與0.05%磷酸，甲醇與0.05%磷酸等不同比例的流動(dòng)相試驗(yàn)，但均不能達(dá)到滿意效果，采用甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.1 moL/L 的磷酸二氫鉀溶液和0.1 moL/L 的磷酸二氫鈉溶液等量混合）一水（3.0 ∶4.5 ∶92.5）為流動(dòng)相后，天麻素與相鄰色譜峰分離度符合要求，陰性無干擾。色譜圖如圖2～圖4 所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖3 試樣溶液的色譜圖

圖4 不含天麻素的陰性試樣溶液色譜圖

2.1.3 方法驗(yàn)證

（1）提取條件的考察實(shí)驗(yàn)。取本品20 片，于研缽中研成細(xì)粉，精密稱取細(xì)粉1.0 g（精確至0.000 1 g），于具塞錐形瓶中，考察不同體積的甲醇用量（15 mL、20 mL、30 mL、40 mL）、超聲時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）等，以考察提取效率，結(jié)果：加甲醇15 mL[9]，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min 后再重復(fù)1 次，試樣溶液色譜圖中天麻素峰面積穩(wěn)定，故選擇甲醇15 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min[8]將甲醇液轉(zhuǎn)移至30 mL 容量瓶中，于殘?jiān)屑蛹状?5 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min。

（2）線性范圍考察。液相色譜法的自動(dòng)進(jìn)樣器精密吸取2.1.1 項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL 注 入 高效液相色譜儀，按2.1.2 節(jié)儀器參考條件測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與進(jìn)樣量，計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果：線性回歸方程為Y=655 428X-651 265，R2=0.999 7，天麻素在0.191～5.73μg 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

（3）精密度實(shí)驗(yàn)考察。取2.1.1 節(jié)標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按2.3.1 節(jié)儀器參考條件測(cè)定，連續(xù)6 次，記錄天麻素色譜峰面積，計(jì)算6 次進(jìn)樣色譜圖中天麻素峰面積RSD（n=6）為0.2%，該方法精密度良好。

（4）穩(wěn)定性的考察實(shí)驗(yàn)。取2.1.1 節(jié)試樣溶液，在室溫放置0，4，8，12，24，48 h 后，按2.1.2 節(jié)儀器參考條件測(cè)定，記錄天麻素峰面積，根據(jù)不同時(shí)間的天麻素峰面積，計(jì)算RSD 為0.6%（n=6），該方法試樣溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性好。

（5）重復(fù)性的考察實(shí)驗(yàn)。取天麻洋參含片試樣（批號(hào)：20200909），精密稱取6 份，按2.1.1 節(jié)實(shí)驗(yàn)溶液的制備方法制備試樣溶液，按2.1.2 節(jié)儀器參考條件測(cè)定峰面積，結(jié)果：記錄天麻素色譜峰面積，其RSD為0.8%，試樣天麻素的平均含量為 2.659 4 mg/g。本方法重復(fù)性好。

（6）準(zhǔn)確度的考察實(shí)驗(yàn)。采用加樣回收率法[15]，取已知含量的試樣9 份（批號(hào)：20200909，2.66 mg/g），按50%、100%、150% 量分別加入天麻素標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1.1 節(jié)實(shí)驗(yàn)溶液的制備方法配制低、中、高3 組濃度的試樣溶液，每1 制備濃度2 份，按2.1.2 節(jié)儀器參考條件測(cè)定天麻素含量，計(jì)算回收率。結(jié)果：天麻素平均回收率為97.6%（n=9）。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 天麻素回收率測(cè)定結(jié)果表（n=9）

（7）限度確定。取天麻洋參含片試樣3 批，按已確定的方法測(cè)定每批含量。結(jié)果，3 批試樣天麻素平均含量為2.662 mg/g，相對(duì)偏差為1.5%。按3 批試樣天麻素平均含量約70%含量確定本品天麻素含量為不低于1.8 mg/g。

2.2 人參總皂苷含量測(cè)定

2.2.1 實(shí)驗(yàn)溶液的制備方法

（1）試樣溶液的制備方法。取本品適量，研細(xì)，取細(xì)粉1 g，精密稱定，置100 mL 的容量瓶中，加適量水超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，靜置10 min，吸取上清液1.0 mL，加入已處理好的中性氧化鋁與AmberLite-XAD-2 復(fù)合層析柱，分別用水、70%乙醇洗滌，收集70%乙醇洗滌液于蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴揮干，加0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液使殘?jiān)芙?，再加?.8 mL 高氯酸，轉(zhuǎn)入5 mL 具塞刻度離心管中，60 ℃水浴上加熱10 min，取出、放冷，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻，即得。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法。精密稱取人參皂昔Re 20 mg，置25 mL 容量瓶中[7]，加甲醇溶解并稀釋至刻度，吸取100 μL 于蒸發(fā)皿中蒸干，按照2.2.1 節(jié)試樣溶液配制60 ℃水浴蒸干后，相同方法操作，即得。

（3）不含西洋參陰性試樣溶液的配制。除西洋參陰性試樣，按2.2.1 節(jié)實(shí)驗(yàn)溶液的制備方法制成不含西洋參陰性試樣溶液。

2.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇實(shí)驗(yàn)

取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液、試樣溶液、陰性試樣溶液，在190～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果：560 nm 處，標(biāo)準(zhǔn)溶液、試樣溶液均有一個(gè)明顯的吸收峰，陰性試樣溶液未見吸收峰，故選定560 nm 為試樣的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察實(shí)驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液20、40、60、80、100、150、200μL，置于蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴揮干，照2.2.1 節(jié)試樣溶液制備方法，在60 ℃水浴蒸干后同法操作，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照紫外-可見分光光度法于560 nm 處測(cè)定吸光度，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，縱坐標(biāo)為吸光度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其相關(guān)系數(shù)，線性回歸方程為y=0.482 1x-0.059 2，R2=0.999 5。人參皂苷在0.191～5.73μg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度的實(shí)驗(yàn)考察

取供試品6 份，每份1.0 g，按上述2.2.2（1）節(jié)所述方法處理，記錄吸光度值，計(jì)算 RSD=0.82%，表明方法精密度良好。

2.2.5 準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)考察

采用加樣回收率法[15]，取已知含量的試樣9 份（0.5 g），分別加入50%、100%、150%的人參總皂苷，按2.2.1 節(jié)處理，測(cè)定各試樣的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果：回收率在95.6%～98.2%，平均回收率為96.8%，RSD=0.9%。此方法的準(zhǔn)確度高。（見表2）

表2 人參總皂苷準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果表（n=9）

2.2.6 限度制定

測(cè)定3 批天麻洋參含片試樣，其均值為1.031 31 mg/g，按70% 含量計(jì)算，則本品每100 g含總皂苷不低于720 mg。

3 結(jié)論

天麻和西洋參均是藥食同源品種。天麻中所含的天麻素是緩解疲勞的活性成分[10]。西洋參具有抗癌、抗缺氧和抗疲勞、抗糖尿病、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用[11]。人參皂苷是西洋參的主要活性成分和重要質(zhì)量控制指標(biāo)[12]，其含量是人參的很多倍，具有抗疲勞、抗腫瘤等多方面的藥理活性[13]。天麻西洋參含片中天麻素和人參總皂苷含量的測(cè)定是保證產(chǎn)品質(zhì)量、維護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益的有效手段之一。

本文研究建立了適用于天麻洋參含片天麻素[14]含量測(cè)定的液相色譜法，該方法適用范圍廣、專屬性強(qiáng)，適用于以人參總皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外可見分光光度法測(cè)定其總皂苷含量[15-16]。結(jié)果表明：本文的研究方法具有簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是用于天麻素和總皂苷成分保健食品簡(jiǎn)單、及時(shí)、有效的監(jiān)測(cè)方法，為其標(biāo)準(zhǔn)制定提供了科學(xué)參考，可以滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制及市場(chǎng)監(jiān)管的需求。