網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張赟赟，巫 凱，嚴(yán) 赟，郭雯雯，黃 莉，王彩玉

（1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021；3.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

網(wǎng)絡(luò)雞血藤根是豆科植物網(wǎng)絡(luò)崖豆藤M(fèi)illetia reticulataBenth 的干燥根，味苦，有毒，分布于我國(guó)西南、華東、華中、華南等地區(qū)，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、強(qiáng)筋骨、鎮(zhèn)靜功效。該藥材為廣西瑤族傳統(tǒng)習(xí)用藥材，多用于外治風(fēng)濕筋骨痛、四肢麻木、腰膝酸痛、癱瘓、跌打損傷等病癥［1-2］?，幩幱捎跓o(wú)科學(xué)、系統(tǒng)、規(guī)范的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，很多具有民族醫(yī)藥特色的藥材及藥方不能直接進(jìn)行成藥、制劑開(kāi)發(fā)，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限。近年來(lái)，地方政府多次組織了廣西常用民族藥、瑤族民間用藥、瑤藥資源普查及開(kāi)發(fā)利用研究等大量基礎(chǔ)性工作，初步制定了瑤藥的范疇和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。本研究中擬建立網(wǎng)絡(luò)雞血藤根的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695 - 2489 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；BX41 型高分辨生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；SM2010R型平推式切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；LT9/11型馬弗爐（德國(guó)Nabertherm 公司）；ED240 型干燥箱（德國(guó)Binder 公司）；HEIZBAD HRT - VAP 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；IQ7000型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；XS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；S120H 型超聲波清洗儀（瑞士Elma公司）。

1.2 試藥

芒柄花素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111703-200501，含量99.1%）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。10 批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材樣品，均產(chǎn)自廣西（見(jiàn)表1），經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為正品。部分2 號(hào)藥材樣品被制成臘葉標(biāo)本，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室韋松基教授及廣西中醫(yī)藥研究院中藥室賴茂祥研究員和黃云峰副研究員鑒定為正品，以其作為網(wǎng)絡(luò)雞血藤根對(duì)照藥材。

表1 藥材樣品信息Tab.1 Information of medicinal material samples

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

藥材樣品呈圓柱形，表面灰褐色，具細(xì)皺紋及栓皮脫落痕，直徑0.5～5.0 cm。質(zhì)硬，難折斷，斷面顆粒狀，皮部薄、灰褐色，木部黃白色，有細(xì)密的放射狀紋理，無(wú)髓。商品常切成斜片（厚約0.5 cm），氣微，味淡。詳見(jiàn)圖1。

圖1 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材外觀圖A.Overall picture B.Cross sectionFig.1 Appearance of Millettiae Reticulatae Radix

2.2 顯微鑒別

橫切面：木栓層為數(shù)列排列整齊的扁方形或方圓形細(xì)胞。皮層窄，細(xì)胞圓形或類圓形，石細(xì)胞為數(shù)個(gè)一群且呈斷續(xù)環(huán)狀分布，細(xì)胞壁較厚，孔溝明顯。韌皮部較寬，細(xì)胞類圓形或不規(guī)則形，韌皮纖維為數(shù)個(gè)一群且呈散在分布，纖維壁較薄，非木化或微木化，周圍的薄壁細(xì)胞有的含有草酸鈣方晶且形成晶纖維，有的含淀粉粒。木質(zhì)部較寬，由導(dǎo)管、木纖維和木薄壁細(xì)胞組成，木纖維和木薄壁細(xì)胞相間排列，導(dǎo)管單個(gè)或多個(gè)相連，呈放射狀分布，直徑30～185μm，木射線細(xì)胞2～8 列。詳見(jiàn)圖2。

圖2 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材橫切面顯微圖A.Cross section B.Phellem and sclerotic cell C.Starch grain in xylem ray D.Phloem（xylem ray and crystal fiber）E.Xylem（vessel，xylem ray and wood fiber bundle）Fig.2 Cross-section micrograph of Millettiae Reticulatae Radix

粉末：棕黃色。纖維成束或分離，先端圓鈍或折斷，部分纖維周圍的薄壁細(xì)胞含有草酸鈣方晶形成晶纖維，纖維直徑12～33μm。石細(xì)胞為單個(gè)或多個(gè)相連，細(xì)胞壁較厚，孔溝明顯，直徑20～55μm。草酸鈣方晶呈方形或不規(guī)則形，直徑9～35μm。淀粉粒為散在或存在于薄壁細(xì)胞中，單?；驈?fù)粒，圓形、半圓形或雞嘴形，臍點(diǎn)點(diǎn)狀或裂縫狀，直徑5～15μm。導(dǎo)管為具緣紋孔導(dǎo)管，直徑22～118μm。木栓細(xì)胞呈類方形或多角形，棕黃色或灰白色，細(xì)胞壁較厚。詳見(jiàn)圖3。

圖3 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材粉末顯微圖A.Crystal fiber B.Calcium oxalate square crystal C.Starch grain D.Sclerotic cells E.Duct F.Cork cellsFig.3 Micrograph of the powder of Millettiae Reticulatae Radix

2.3 薄層色譜（TLC）鑒別

取藥材樣品粉末2 g，加甲醇30 mL，超聲（功率200 W，頻率37 kHz；下同）提取30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取對(duì)照藥材粉末2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法，吸取上述溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿- 丙酮- 甲醇- 氨（6∶3∶0.5∶0.1，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 薄層色譜圖1，3-10.Test solution 2.Reference medicinal materials solutionFig.4 TLC chromatograms

2.4 水分、灰分、浸出物檢查

水分：按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832 第二法烘干法測(cè)定。結(jié)果藥材樣品含水量為3.07%～9.98%，平均7.01%。詳見(jiàn)表2。

總灰分：按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2302灰分項(xiàng)下總灰分測(cè)定法測(cè)定。結(jié)果藥材樣品中總灰分含量為2.47%～4.69%，平均3.39%。詳見(jiàn)表2。

靜電分離法是70年代興起的液固分離技術(shù)，原理是當(dāng)油漿流經(jīng)填料床層時(shí)，催化油漿中的固體微粒在高壓電場(chǎng)作用下被極化帶上電荷，從而被填料吸附，達(dá)到凈化油漿的目的。最早的靜電分離器是由美國(guó)的海灣石油公司設(shè)計(jì)研發(fā)制造，美國(guó)的阿瑟港石油公司用于工業(yè)應(yīng)用。之后國(guó)內(nèi)很多研究機(jī)構(gòu)做了大量的研究和技術(shù)改進(jìn)，趙娜[3]等人在Caoqing[4]，Abidin[5]等人的研究基礎(chǔ)上自制靜電分離裝置，通過(guò)三級(jí)靜電分離對(duì)重油催化油漿的固體顆粒物脫除率高達(dá)99%。雖然靜電分離法脫除率高，但該法對(duì)10μm以下的顆粒物分離效果顯著，且所需設(shè)備復(fù)雜，分離效果受油漿性質(zhì)、操作條件影響，因此在我國(guó)還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用。

酸不溶性灰分：按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2302 灰分項(xiàng)下酸不溶性灰分測(cè)定法測(cè)定。結(jié)果藥材樣品中酸不溶性灰分含量為0.16%～0.59%，平均0.31%。詳見(jiàn)表2。

表2 藥材樣品水分、灰分、浸出物含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.2 Results of the content determination of moisture，ash and extract in medicinal material samples（%）

浸出物：按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2201 項(xiàng)下的熱浸法（以水為溶劑）測(cè)定。結(jié)果藥材樣品中浸出物含量為9.06%～23.20%，平均16.45%。詳見(jiàn)表2。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

色譜柱：RP- 18 Endcapped 柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸水溶液（32∶68，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：249 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.5.2 溶液制備

取芒柄花素對(duì)照品9.96 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.098 7 mg/mL 的對(duì)照品溶液。取藥材樣品粉末（過(guò)2 號(hào)篩）約3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入100 mL甲醇，加熱回流30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒁浦? mL 容量瓶，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察

圖5 高效液相色譜圖1.Formononetin A.Reference solution B.Test solutionFig.5 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.5.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5，1，2，3，4，5，10 mL，置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取20μL，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以芒柄花素質(zhì)量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 122 430X-50 575.94（r=0.999 8）。結(jié)果表明，芒柄花素質(zhì)量濃度在4.94～98.70 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.5.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液（2 號(hào)樣品）適量，按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，芒柄花素峰面積的RSD為0.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.5.2項(xiàng)下供試品溶液（1號(hào)樣品）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，14，22 h時(shí)按2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芒柄花素峰面積的RSD為0.71%（n= 6），表明供試品溶液在室溫放置22 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取樣品（1 號(hào)樣品）粉末適量，精密稱定，各6 份，按2.5.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，芒柄花素的平均含量為50.61 μg/ g，RSD為1.27%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（1 號(hào)樣品）適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的芒柄花素對(duì)照品溶液，按2.5.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.5.4 樣品含量測(cè)定

取藥材樣品粉末各適量，分別按2.5.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.4 Results of the content determination of formononetin in samples（μg/g，n=3）

3 討論

根據(jù)10 批藥材樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及芒柄花素含量測(cè)定結(jié)果，前四者以10 批藥材樣品數(shù)據(jù)中的最（大，?。┲嫡{(diào)整20%為限度值，含量以10批藥材樣品數(shù)據(jù)的平均值下調(diào)20%為限度值。建議網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材水分含量不得過(guò)12.0%，總灰分含量不得過(guò)6.0%，酸不溶性灰分含量不得過(guò)1.0%，浸出物含量不得低于8.0%，芒柄花素含量不得少于42μg/g。

TLC預(yù)試驗(yàn)中進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)考察，采用點(diǎn)狀點(diǎn)樣對(duì)自制板、預(yù)制板的展開(kāi)效果，不同展開(kāi)溫度（5，35 ℃），以及不同相對(duì)濕度（30%，80%）進(jìn)行考察。結(jié)果均表明本方法的耐用性良好。

由網(wǎng)絡(luò)雞血藤根指紋圖譜前期研究可知其含有芒柄花素成分［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，芒柄花素能促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)，促進(jìn)骨再生，對(duì)股骨頭壞死有治療作用［4-5］，且能預(yù)防絕經(jīng)期后女性和老年人骨質(zhì)疏松［6］，這與其功能主治中的通經(jīng)活絡(luò)、強(qiáng)筋骨相適應(yīng)。有研究表明，芒柄花素具有調(diào)血脂、對(duì)多種腫瘤有抑制作用及抗炎抑菌等作用［7-15］，故芒柄花素用于網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)具有一定意義。

綜上所述，本研究中建立的標(biāo)準(zhǔn)可用于網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材的質(zhì)量控制。