輔助生殖中胚胎質(zhì)量評估方法的研究進展

溫美婷，孫虹

近年來不孕癥發(fā)病率逐漸增加，部分患者需要通過輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)實現(xiàn)生育要求。ART經(jīng)過四十多年的飛速發(fā)展，取得巨大進步，然而其成功率依然不高。如何提高ART成功率成為研究熱點，其中選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植對ART成功與否至關(guān)重要。目前臨床胚胎質(zhì)量評估主要基于靜態(tài)的形態(tài)學(xué)評估，該方法不能動態(tài)觀察胚胎發(fā)育過程，無法了解胚胎基因組學(xué)異常。胚胎延時成像(time-lapse imaging,TLI)技術(shù)，可實現(xiàn)動態(tài)觀察胚胎形態(tài)變化，并通過形態(tài)動力學(xué)參數(shù)評估胚胎質(zhì)量。然而部分非整倍體胚胎能夠呈現(xiàn)最佳的形態(tài)學(xué)[1]導(dǎo)致妊娠失敗。近年來，胚胎植入前基因檢測(preimplantation genetic testing,PGT)的應(yīng)用，通過篩選染色體正常的胚胎移植，可顯著提高胚胎植入率和臨床妊娠率，但PGT技術(shù)的有創(chuàng)性以及高成本限制其在臨床上的廣泛使用。近幾年隨著對胚胎培養(yǎng)基的深入研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中胚胎組學(xué)和胚胎基因?qū)W與胚胎質(zhì)量具有相關(guān)性，為無創(chuàng)性胚胎質(zhì)量評估提供發(fā)展方向。本文擬介紹目前三類胚胎質(zhì)量評估方法的現(xiàn)狀和研究進展，總結(jié)分析各方法在胚胎質(zhì)量評估方面的優(yōu)缺點，為臨床胚胎質(zhì)量評估提供參考。

1 胚胎形態(tài)學(xué)評估

1.1 靜態(tài)的胚胎形態(tài)學(xué)評估

靜態(tài)的胚胎形態(tài)學(xué)評估主要在胚胎原核期、胚胎卵裂期、囊胚期進行評估。在卵細胞受精后16 h～20 h出現(xiàn)胚胎原核，稱為原核期。Scott L等[2]對原核期胚胎以原核、核仁的排列、細胞質(zhì)外觀、核仁大小、數(shù)目和分布提出Z評分系統(tǒng)。2011年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會指南根據(jù)原核的均勻性和核仁前體提出原核評分[3]。胚胎發(fā)生第一次有絲分裂進入卵裂期，卵裂期主要基于卵裂球數(shù)目、大小、均一性、細胞碎片、多核等形態(tài)進行評估。Istanbul 共識[3]根據(jù)卵裂球大小、細胞碎片、有無多核分為三個等級評估胚胎質(zhì)量。國內(nèi)將第3天卵裂期的優(yōu)質(zhì)胚胎定義為正常受精卵，且受精后第3天胚胎細胞數(shù)為7～9個、細胞大小符合發(fā)育階段、碎片程度小于10%、無多核化的胚胎[4]。胚胎發(fā)育至第5～6天形成囊胚，綜合囊胚擴張狀態(tài)、內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞發(fā)育形成Gardner評分體系。靜態(tài)的胚胎形態(tài)學(xué)評估仍然是臨床評估胚胎質(zhì)量最常用方法，但其無法準確反映胚胎發(fā)育潛能，原核期和卵裂期沒有統(tǒng)一標(biāo)準的評估方法，實驗室技術(shù)人員評估胚胎形態(tài)時存在主觀因素的影響，無法反映胚胎遺傳學(xué)情況等問題。

1.2 動態(tài)的胚胎形態(tài)學(xué)評估

1.2.1 TLI TLI通常使用一個獨立的培養(yǎng)箱，其中安裝一個或多個集成倒置顯微鏡和數(shù)碼相機收集胚胎圖像，優(yōu)化胚胎形態(tài)學(xué)評估，實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測胚胎發(fā)育。通過連續(xù)性觀察胚胎的形態(tài)、動態(tài)和時間參數(shù)變化，建立胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)模型評估胚胎質(zhì)量。

1.2.2 TLI與形態(tài)動力學(xué) Meseguer M等[5]展開一項多中心的回顧性研究，選擇7 305個卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期胚胎，其中1 390個胚胎使用延時培養(yǎng)箱和使用首次提出的形態(tài)動力學(xué)多變量模型[6]評估胚胎質(zhì)量，另外5 915個胚胎使用傳統(tǒng)培養(yǎng)箱和靜態(tài)形態(tài)學(xué)評估，發(fā)現(xiàn)延時培養(yǎng)箱培養(yǎng)和選擇胚胎移植的臨床妊娠率增加20.1%。研究指出臨床妊娠率提高的原因可能有：① 嚴格控制和穩(wěn)定的孵化條件；② 減少對培養(yǎng)箱內(nèi)的胚胎處理；③ 增加胚胎發(fā)育信息對形態(tài)進行定性評估；④ 使用定量形態(tài)動力學(xué)參數(shù)來選擇有活力的胚胎。Basile N等[7]在Meseguer M等[6]的研究基礎(chǔ)上增加新的形態(tài)動力學(xué)參數(shù)評估，將胚胎植入潛力從A到E進行分類，發(fā)現(xiàn)A類至E類的植入率呈顯著下降(“A”32%、“B”28%、“C”26%、“D”20% 和“E”17%，P<0.001)。同時，在一項前瞻性隨機對照研究中，也發(fā)現(xiàn)延時培養(yǎng)箱和基于多變量模型選擇的胚胎持續(xù)妊娠率為51.4%，而對照組傳統(tǒng)培養(yǎng)箱和基于靜態(tài)形態(tài)學(xué)評估持續(xù)妊娠率為 41.7%[8]。近來，Dal Canto M等[9]發(fā)現(xiàn)使用形態(tài)動力學(xué)選擇第2天胚胎移植的妊娠率與冷凍囊胚移植的臨床妊娠率相似(40.6% vs 45.7%)。通過延時培養(yǎng)箱和形態(tài)動力學(xué)評估胚胎質(zhì)量，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植提高了妊娠率。Coticchio G等[10]進一步分析胚胎受精的形態(tài)動力學(xué)，提出原核染色質(zhì)極化的動力學(xué)具有預(yù)測胚胎發(fā)育的潛力。在胚胎卵裂期，Yang SH[11]等建立預(yù)測囊胚形成的分層模型，其中A、B、C、D類囊胚形成率分別為80.0%、77.8%、53.7%、22.2%(P<0.001)。學(xué)者進一步提出在卵裂期2～8細胞階段對預(yù)測囊胚形成更有價值(AUC=0.732)[12]，結(jié)合原核期和卵裂期形態(tài)動力學(xué)參數(shù)也可用于區(qū)分囊胚期的胚胎形態(tài)等級[13]。對于胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)應(yīng)用仍在積極探索中，目前關(guān)于TLI和形態(tài)動力學(xué)評估的臨床效果尚存差異，且此技術(shù)所需儀器價格昂貴、觀察標(biāo)本數(shù)量有限等問題尚未有效解決，形態(tài)動力學(xué)參數(shù)模型尚無統(tǒng)一標(biāo)準，因此臨床上未廣泛應(yīng)用。

1.2.3 TLI與人工智能 Tran D等[14]基于8個體外受精(IVF)實驗室的延時數(shù)據(jù)，使用人工智能技術(shù)建立預(yù)測胚胎臨床妊娠的深度學(xué)習(xí)模型，其模型預(yù)測胚胎植入和臨床妊娠有效(AUC=0.93)，因其延時數(shù)據(jù)來自于兩個不同孵化器系統(tǒng)，因此對于其他延時孵化器系統(tǒng)的適用性仍不清楚。Berntsen J等[15]基于115 832個胚胎的延時數(shù)據(jù)開發(fā)深度學(xué)習(xí)模型，其預(yù)測結(jié)果與囊胚分級呈正相關(guān)。另一方面人工智能分析模型通過預(yù)測無法植入的非整倍體胚胎，選擇具有植入潛力胚胎移植，從而提高妊娠率方面也具有價值[16-17]。人工智能實現(xiàn)完全自動化的胚胎形態(tài)學(xué)評估，意味著更少的人工評估，能消除由于實驗操作人員之間差異導(dǎo)致的偏差，目前其標(biāo)準的預(yù)測模型尚未完全建立，其臨床適用性待進一步評估。

1.2.4 TLI與胚胎染色體 在形態(tài)動力學(xué)參數(shù)中，Vera-Rodriguez M等[18]發(fā)現(xiàn)整倍體與非整倍體胚胎的原核消失時間和第一次胞質(zhì)分裂開始之間存在差異。胚胎在發(fā)育至囊胚時，整倍體胚胎的形態(tài)動力學(xué)參數(shù)(原核數(shù)、t2、t3、t4、t5、tB、ICM 和 TE 等級)高于非整倍體胚胎[19]。一項Meta分析在探討非整倍體胚胎和形態(tài)動力學(xué)的關(guān)系時，指出非整倍體在胞質(zhì)分裂時具有延遲，表明延時的形態(tài)動力學(xué)在評估胚胎質(zhì)量方面具有價值[20]。通過延時形態(tài)動力學(xué)評估了解胚胎染色體倍體情況，是無創(chuàng)評估胚胎質(zhì)量的一個新方向，不僅能縮短胚胎移植的時間，還能降低ART治療的成本。然而目前胚胎形態(tài)動力學(xué)與胚胎染色體的關(guān)系尚未完全確定，其相關(guān)評估模型需要更多的數(shù)據(jù)支持。

2 有創(chuàng)性胚胎植入前基因檢測

通過檢測胚胎染色體情況，移植染色體正常的胚胎，降低流產(chǎn)率，降低胎兒先天缺陷率等優(yōu)勢已形成臨床共識。PGT主要是獲取囊胚滋養(yǎng)外層(trophectoderm,TE)5～10個細胞后，使用基因診斷技術(shù)進行遺傳學(xué)分析，從而得到胚胎染色體情況。PGT在高齡產(chǎn)婦、單基因病、反復(fù)植入失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床應(yīng)用價值是肯定的。然而PGT的關(guān)鍵步驟之一是對胚胎活檢，其操作如何避免對胚胎產(chǎn)生的損傷，安全地獲得胚胎遺傳物質(zhì)仍是PGT面臨的問題。Scott JR等[21]發(fā)現(xiàn)第3天卵裂期活檢后胚胎植入率比未活檢胚胎植入率減少39%，對囊胚行TE活檢的胚胎植入率沒有差異，造成這種差異也不能排除胚胎學(xué)家活檢的經(jīng)驗和技術(shù)的影響。另外也有研究表明，去除大量TE可能與較低的出生率有關(guān)[22-23]。同時，在活檢時收集細胞的位置可能影響胚胎植入前非整倍體檢測(PGT-A)的結(jié)果[24]。并且TE活檢無法完全代表內(nèi)細胞團(inner cell mass,ICM)的情況，因TE和發(fā)育成胎兒的內(nèi)細胞團中的染色體數(shù)量并不總是相同，所以胚胎嵌合體會影響TE活檢的準確性[25]。因此目前PGT僅針對某些特定人群使用，未在臨床上廣泛使用。

3 無創(chuàng)性胚胎質(zhì)量評估

3.1 胚胎組學(xué)

3.1.1 胚胎代謝組學(xué) 研究中采用光譜分析培養(yǎng)基中胚胎代謝物的變化，檢測培養(yǎng)基中代謝物含量，進而評估胚胎質(zhì)量。Brison DR等[26]提出測量氨基酸濃度變化有助于胚胎篩選。Huo P等[27]使用高效液相色譜分析第3天胚胎移植后培養(yǎng)基中的8種氨基酸，發(fā)現(xiàn)絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸和丙氨酸在妊娠組和非妊娠組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以90.4%的準確性預(yù)測胚胎植入潛力。由于研究中收集第3天培養(yǎng)基且樣本量有限，因此在其他時間收集培養(yǎng)基產(chǎn)生的結(jié)果需要進一步研究，還需更大樣本量來支持此結(jié)果。近來，Olcay IO等[28]發(fā)現(xiàn)非整倍體培養(yǎng)基中酪氨酸濃度顯著高于整倍體(P<0.003)，提出培養(yǎng)基中酪氨酸水平≥76.38 mmol/L可視為非整倍體。學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)基中某些特異性物質(zhì)與胚胎發(fā)育潛能有關(guān),如較高的人可溶性白細胞抗原G(sHLA-G)濃度與臨床妊娠率有關(guān)[29]。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中 sCD146濃度高，其胚胎著床率較低[30]。有學(xué)者研究培養(yǎng)基中的細胞因子，發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)胚胎培養(yǎng)基中 CCL15、CCL27和 CXCL12 的濃度升高，認為細胞因子可用于預(yù)測胚胎質(zhì)量[31],其研究樣本量較小，且不孕癥的原因具有異質(zhì)性，需要大樣本量的進一步研究來闡明細胞因子水平與臨床妊娠率之間的關(guān)聯(lián)。

3.1.2 胚胎蛋白組學(xué) 隨著轉(zhuǎn)化技術(shù)的進步，可以檢測胚胎培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)分泌或消耗的情況，了解胚胎蛋白組學(xué)與胚胎發(fā)育的關(guān)系。Dominguez F等[32]發(fā)現(xiàn)植入胚胎與未植入的胚胎之間，IL-6蛋白含量存在顯著差異，提出IL-6 蛋白是選擇囊胚的潛在預(yù)測指標(biāo)。Bori L等[33]將蛋白質(zhì)組學(xué)特征和TIL結(jié)合，建立人工智能模型，通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)通過使用IL-6和MMP-1的人工智能模型預(yù)測活產(chǎn)(AUC=1.0)，其研究僅涉及一個實驗室和一種培養(yǎng)基，對其他實驗室的實用性還不確定，進一步研究應(yīng)具有更大樣本量和來自多中心的不同延時系統(tǒng)數(shù)據(jù)。也有學(xué)者提出囊胚培養(yǎng)基中IL-6和MMP-1濃度結(jié)合TLI預(yù)測胚胎整倍體準確度超過80%[34]，然而仍面臨胚胎數(shù)目較少，樣本量不足，且檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)敏感性不高等問題。

3.1.3 胚胎轉(zhuǎn)錄組學(xué) 轉(zhuǎn)錄組是細胞中核糖核酸轉(zhuǎn)錄物的總稱；通過對mRNA分析得出細胞特異性基因表達的特征進而了解細胞代謝的動態(tài)。Yan L等[35]發(fā)現(xiàn)人類外胚層細胞和人類胚胎干細胞的生長具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄組。Sanchez-Ribas I等[36]通過分析21三體、21單體和整倍體囊胚的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)21單體和整倍體囊胚之間HSA21的轉(zhuǎn)錄組存在差異，以及21單體和21三體囊胚轉(zhuǎn)錄組之間存在更大的差異。Zhou Q等[37]收集第3天和第5天胚胎培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)miRNA的表達在不同胚胎發(fā)育階段濃度不同，piRNA 有大量的表達，指出培養(yǎng)基中的游離的RNA可能是與胚胎質(zhì)量相關(guān)的潛在標(biāo)志物。

3.1.4 胚胎表觀基因組學(xué) 表觀遺傳是指在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達和功能的誘導(dǎo)及維持發(fā)生了可遺傳的變化。DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)是胚胎發(fā)生中的關(guān)鍵表觀遺傳指標(biāo)。Li L等[38]發(fā)現(xiàn) DNA 甲基化與受精卵中啟動子的染色質(zhì)可及性和整個植入前發(fā)育之間呈負相關(guān)。Zhou F等[39]通過分析來自65個植入期胚胎的8 000 多個單個細胞，發(fā)現(xiàn)在植入過程中，原始內(nèi)胚層譜系細胞中基因組的重新甲基化比外胚層和滋養(yǎng)外胚層譜系的細胞慢得多,提出外胚層和原始內(nèi)胚層的DNA甲基化具有明顯的重建特征。Rosenbluth EM等[40]在培養(yǎng)第5天的新鮮囊胚培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，非整倍體培養(yǎng)基和失敗的IVF周期培養(yǎng)基中含有較高水平的MicroRNA，提出MicroRNA可能是胚胎非整倍體和妊娠失敗的生物標(biāo)志物。

胚胎組學(xué)作為評估胚胎質(zhì)量的新興研究，其無創(chuàng)性和不限定特定的生物標(biāo)志物凸顯了臨床優(yōu)勢。現(xiàn)已證明胚胎組學(xué)與胚胎質(zhì)量具有相關(guān)性，然而目前研究局限于研究樣本量較少，沒有建立胚胎組學(xué)相關(guān)技術(shù)平臺，也沒有評估胚胎質(zhì)量的確切標(biāo)準。對于胚胎代謝組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和表觀基因組學(xué)還需要更大規(guī)模的研究來探索不同組學(xué)的特征，研究其來源機制，構(gòu)建其預(yù)測模型，建立其評估技術(shù)，從而進一步研究來闡明組學(xué)與胚胎質(zhì)量之間的關(guān)系，解決胚胎組學(xué)評估方法在臨床開展的應(yīng)用問題。

3.2 無創(chuàng)性植入前基因檢測

無創(chuàng)植入前基因檢測又稱無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)(noninvasive embryonic chromosome screening technique,NICS)，其通過檢測胚胎培養(yǎng)基中的染色體進行遺傳學(xué)分析，從而了解胚胎染色體情況。Stigliani S等[41]首次發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)基中存在游離的DNA(cell-free DNA,cfDNA)。進一步研究發(fā)現(xiàn)cfDNA與囊胚形成和胚胎植入具有相關(guān)性[42]。Huang L等[43]將52個經(jīng)過TE活檢后冷凍的囊胚解凍，單獨培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基，使用全基因組擴增和下一代測序技術(shù)進行非整倍性的無創(chuàng)性植入前基因檢測(non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploid，niPGT-A)，將鑲嵌百分比為60% 作為區(qū)分非整倍體和整倍體胚胎的閾值以及去除變異系數(shù)大的樣本，保留變異系數(shù)<0.19的樣本分析，發(fā)現(xiàn)niPGT-A和TE活檢PGT-A的陽性預(yù)測值分別為91.7%(33/36)和78.0%(32/41)；niPGT-A和TE活檢PGT-A的特異性分別為80%(12/15)和50%(9/18)；與TE活檢相比，假陰性率為0%，認為niPGT-A 比TE活檢 PGT-A更優(yōu)。此研究樣本量較小，大部分捐贈的胚胎經(jīng)TE活檢檢測為非整倍體，限制了樣本的普遍性；胚胎之前已經(jīng)過活檢、冷凍后在第 5 天或第 6 天解凍，因此研究結(jié)果無法替代臨床普遍情況。

Fang R等[44]對雙方染色體正常和至少一名伴侶染色體重排夫婦的164囊胚培養(yǎng)基中cfDNA進行全基因組擴增和下一代測序，發(fā)現(xiàn)染色體重排夫婦的95個胚胎NICS的結(jié)果中，41個胚胎(43.2%)是整倍體，31個(32.6%)是非整倍體，17個(17.9%)顯示嵌合體，其中6個胚胎(6.3%)中無法確定倍性；正常核型夫婦的75個胚胎NICS結(jié)果中，38個(50.7%)為整倍體，21個(28.0%)為非整倍體，16個(21.3%)為嵌合體；囊胚移植后總體臨床妊娠率為58%(核型正常夫婦為 64%，染色體重排夫婦為 52%)，這與當(dāng)前研究基于下一代測序的染色體重排患者接受PGT的研究中報道的45.1% 的妊娠率相似[45]。NICS標(biāo)本來自培養(yǎng)基，從而避免有創(chuàng)性胚胎操作，降低對胚胎的傷害，降低活檢的費用，增加廣泛開展的適用性，但同時它容易受到精子和卵丘顆粒細胞的污染[46-47]，且使用胚胎培養(yǎng)基中游離的DNA進行擴增時，其擴增率均無法達到100%[44,46]。近來研究者發(fā)現(xiàn)，niPGT-A和TE活檢之間的倍性一致率在第5天囊胚組為72.6%，在第6天囊胚組為 84.8%[48]，提出cfDNA量與胚胎培養(yǎng)時間相關(guān)。NICS可能成為有創(chuàng)性PGT-A的替代方法,然而樣本污染、樣本擴增率等問題尚未有效解決。

4 總結(jié)與展望

如何找到一種快速、客觀、準確、全面且無創(chuàng)的胚胎質(zhì)量評價方法，選擇最具有潛力的胚胎移植，提高ART的成功率，是仍未解決的難題。靜態(tài)的胚胎形態(tài)學(xué)評估仍然是臨床評估胚胎質(zhì)量最常用的方法，TLI及胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)的提出，給胚胎形態(tài)學(xué)評估提出新方向，但均存在無法判斷胚胎染色體是否異常的情況。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)雖然通過對囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞進行遺傳學(xué)分析，得到相關(guān)胚胎染色體信息，但因其對胚胎是有創(chuàng)操作以及存在胚胎嵌合狀態(tài)影響胚胎評判結(jié)果的情況，其實施有一定的局限性，僅限于有相關(guān)準入資質(zhì)的醫(yī)療機構(gòu)開展。目前處于研究熱點的無創(chuàng)胚胎質(zhì)量評估方法，通過對胚胎培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物以及cfDNA的檢測來評估胚胎發(fā)育潛能，雖然解決了對胚胎有創(chuàng)操作的問題，但通過微量代謝產(chǎn)物獲得的信息是否能反映胚胎的真實狀態(tài)，還有待進一步的大數(shù)據(jù)的研究確定。

綜上所述，基于傳統(tǒng)的靜態(tài)胚胎形態(tài)評估方法產(chǎn)生的一系列新的胚胎評估方法，均具有各自優(yōu)勢，但仍面臨著某些尚未解決的問題。將新的胚胎評估方法與胚胎形態(tài)學(xué)評估相結(jié)合，將有望進一步提高胚胎質(zhì)量評估的準確性，進而提高輔助生殖技術(shù)的成功率。