朱 穎, 陳 瑜, 唐 俊, 季秋婷, 王俊杰, 唐伯平, 王 剛

(鹽城師范學(xué)院濕地學(xué)院/江蘇省鹽土生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇鹽城 224007)

田螺科(Viviparidae)貝類是我國淡水水域常見的軟體動(dòng)物,其屬于腹足綱、中腹足目,廣泛分布于湖泊、沼澤、水庫、池塘及溪流等處[1],能對(duì)水體健康起到維持作用,凈化水體,是重要的生態(tài)指示物種[2]。田螺科物種多為經(jīng)濟(jì)貝類,其營養(yǎng)價(jià)值高,螺肉鮮美,是低脂肪、高蛋白食品,在我國廣受歡迎,同時(shí)也是家禽,水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類、蝦蟹類的天然飼料[3]。田螺科貝類屬于世界物種,我國包含9個(gè)屬,70多個(gè)種,其中河螺屬(Rivularia)和螺螄屬(Margarya)為特有屬,環(huán)棱螺屬和圓田螺屬物種最為常見[4]。隨著資源環(huán)境的破壞和對(duì)田螺的需求日益增加,加上外來淡水螺的不斷入侵,我國本土田螺科物種分布和數(shù)量受到嚴(yán)重威脅,很多種群在數(shù)量上明顯衰退,嚴(yán)重的已瀕臨滅絕[5]?；谔锫菘莆锓N的重要生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,保護(hù)和恢復(fù)田螺科物種的多樣性及種群數(shù)量的問題顯得尤為重要。

隨著組學(xué)時(shí)代的到來和發(fā)展,測序成本下降,高通量測序被廣泛用于軟體動(dòng)物基因組測序中。在軟體動(dòng)物中,首個(gè)貝類——太平洋牡蠣(Pacific oyster)基因組圖譜于2012年完成,標(biāo)志著軟體動(dòng)物組學(xué)時(shí)代的到來,填補(bǔ)了軟體動(dòng)物家族基因組圖譜的空白[6]。隨后,霸王蓮花青螺(Lottiagigantea)[7]、章魚(Octopusbimaculoides)[8]、牡蠣(Crassostreavirginica)[9]等其他軟體動(dòng)物的基因組圖譜陸續(xù)發(fā)表,這為其他軟體動(dòng)物的基因組圖譜的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。截至2022年6月,在NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布92個(gè)軟體動(dòng)物基因組圖譜。基因組的解析可為貝類優(yōu)良性狀基因挖掘、遺傳機(jī)制解析提供研究基礎(chǔ)。然而,目前淡水的田螺科貝類分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)相對(duì)薄弱,關(guān)于田螺科的研究大多集中在初步調(diào)查、系統(tǒng)發(fā)育和分類地位等方面的分析[10-12]。在NCBI數(shù)據(jù)庫中,提供的田螺科分子數(shù)據(jù)十分有限,缺乏田螺科貝類參考基因組信息。在構(gòu)建基因組精細(xì)譜圖之前進(jìn)行基因組特征調(diào)研,可為后續(xù)的測序方案提供參考依據(jù)。目前,主要采用K-mer分析方法對(duì)基因組進(jìn)行調(diào)研評(píng)估獲取物種雜合率、重復(fù)度等信息[13-15]。本研究選取淡水田螺科的中華園田螺(Cipangopaludinacathayensis)、銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)、多棱角螺(Angulyagrapolyzonata)、湄公螺(Mekongiarivularia)等4種代表性貝類進(jìn)行基因組調(diào)研,通過K-mer分析,進(jìn)行物種雜合率、基因組重復(fù)序列比例及基因組大小的評(píng)估,以期為田螺科貝類基因組學(xué)研究提供參考。同時(shí),利用Illumina 測序數(shù)據(jù)對(duì)4個(gè)田螺科貝類進(jìn)行初步組裝和初步比較分析,采用MISA工具對(duì)簡單重復(fù)序列(SSR)進(jìn)行鑒定和分析,為進(jìn)一步分子標(biāo)記開發(fā)和資源鑒定提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺和湄公螺,于2021年5—6月分別采集自四川(30°23′36.82″N,104°4′50.46″E)、江蘇鹽城(33°22′33.4″N,120°12′7.19″E)、湖南(27°49′36.25″N,113°7′59.75″E)、江西(28°30′7.34″N,115°48′22.93″E),采集的田螺科樣本保存于江蘇鹽城師范學(xué)院沿海灘涂重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 樣品DNA提取

在江蘇省鹽城師范學(xué)院沿海灘涂重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,使用Omega公司的試劑盒D3373-01 Mollusc DNA Kit(50)提取田螺科4種代表性螺的基因組DNA(取螺的部分樣品),用NanoDrop 光譜儀測定DNA 的濃度和純度。DNA樣本標(biāo)準(zhǔn)為:DNA總量≥20 μg 且濃度≥300 ng/μL;樣本純度要求為:D260 nm/280 nm≥1.8,D260 nm/230 nm≥1.8。

1.3 4種貝類樣本測序和基因組評(píng)估

DNA樣本送到武漢菲沙基因信息有限公司進(jìn)行文庫制備,基于高通量測序儀(MGI-SEQ2000)平臺(tái)采取雙端150 bp(PE150)技術(shù)進(jìn)行測序,測得的數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后用來進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。4種貝類Illumina測序數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫(https://ngdc.cncb.ac.cn/),項(xiàng)目編號(hào):PRJCA013294。

文庫構(gòu)建參照Illumina標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程[16],構(gòu)建并插入片段大小為270 bp的文庫[17]并測序。完成構(gòu)建的文庫在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測序。選用AdapterRemoval(version 2.1.7)軟件對(duì)測序數(shù)據(jù)去接頭,用FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,并過濾質(zhì)粒污染。采用基于K-mer分析進(jìn)行估算,K值取21,在測序reads均勻分布的前提下,計(jì)算基因組大小(基因組大小=總堿基數(shù)/平均測序深度=總K-mer數(shù)平均值/平均K-mer深度)。利用Jellyfish和 GenomeScope 軟件對(duì)K-mer頻數(shù)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并擬合作圖,得到K-mer分布圖。

1.4 基因組組裝和GC深度分析

對(duì)過濾數(shù)據(jù)利用SOAPdenovo軟件進(jìn)行基因組組裝,將讀長(reads)分成100 bp長度的K-mer,再基于 K-mer 數(shù)據(jù)構(gòu)建de Bruijn圖。利用perl腳本對(duì)組裝的基因組進(jìn)行滑窗統(tǒng)計(jì),設(shè)置窗口為10 kb,根據(jù)GC分布和覆蓋深度統(tǒng)計(jì)結(jié)果,應(yīng)用R腳本繪制散點(diǎn)圖。

1.5 簡單重復(fù)序列(SSR)特征分析

對(duì)初步完成組裝的基因組進(jìn)行簡單重復(fù)序列分析。使用微衛(wèi)星識(shí)別工具(microsatellite identification tool,MISA)搜索SSR位點(diǎn)對(duì)于150 bp以上的序列片段(Scaffolds)[18]。同時(shí)運(yùn)行MISA軟件程序的配置文件misa.ini,使用MISA默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田螺科4種貝類基因組測序質(zhì)量和基因組大小評(píng)估

對(duì)Illumina Hiseq PE測序平臺(tái)測得的中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺等4個(gè)代表性貝類的原始數(shù)據(jù),經(jīng)過濾和校正等質(zhì)控步驟后,分別獲得52.59、58.64、55.71、54.90 G的有效數(shù)據(jù),有效數(shù)據(jù)均大于96%(表1)。測序質(zhì)量評(píng)估結(jié)果顯示,4種螺的Q20分別為 96.5%、96.1%、96.4%、96.6%,Q30分別為88.5%、87.5%、88.3%、88.8%,Q20均大于95%,Q30均大于85%,表明4種貝類的測序質(zhì)量較好,滿足分析要求。4種田螺科貝類GC 含量分別為33.4%、33.7%、33.1%、33.8%,GC含量基本持平。

表1 田螺科4種螺基因組調(diào)查測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本研究采用K-mer 的分析方法,取K為21來進(jìn)行物種基因組特征分析,K-mer分布圖如圖1,實(shí)際觀測的K-mer分布為藍(lán)色區(qū)域;測序頻數(shù)較低的K-mer為紅色線條下方區(qū)域(測序錯(cuò)誤);黑色線條下方是可靠的K-mer數(shù)據(jù),用于4種貝類基因組大小的評(píng)估;黃色線條下方區(qū)域是非重復(fù)區(qū)域。由圖1可知,中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺的主峰分別在測序深度18×、18×、45×、23×左右,均只有1個(gè)主峰,說明4種螺均為2倍體。在測序數(shù)據(jù)中去除深度異常的K-mer后,評(píng)估得到4種螺的基因組大小分別為1 353、896、991、1 196 Mb;雜合度分別為0.77%、1.37%、2.41%、0.91%。4種貝類雜合率均大于0.5%,為高雜合基因組。4種螺的重復(fù)序列比例分別為26.2%、26.7%、27.8%、28.8%,比例基本一致(表2)。

表2 田螺科4種螺基因組評(píng)估結(jié)果

2.2 田螺科4種貝類基因組序列初步組裝

利用SOAPdenovo軟件分別對(duì)4種貝類經(jīng)過質(zhì)控處理后得到的高質(zhì)量read,進(jìn)行初步組裝,中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺的基因組大小分別為 1 598、1 845、1 202、1 322 Mb,其中銅銹環(huán)棱螺基因組長度最大,多棱角螺基因組長度最小。4種貝類的Contigs N50分別為690、200、1 025、889 bp(表3)。初步組裝得到的基因組大小與K-mer評(píng)估得到基因組大小有差異,其組裝的基因組大小偏大,這可能雜合度有關(guān),也有可能與二代測序數(shù)據(jù)讀長較短和覆蓋度較低等因素有關(guān)。

2.3 田螺科4種貝類初步組裝的GC含量與覆蓋度分布

對(duì)4種田螺科貝類初步組裝得到的基因組,過濾覆蓋深度10×以下的contig序列,基于覆蓋深度和GC含量繪制成散點(diǎn)圖。由圖2可知,中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺4種螺的GC含量較為一致,在27%～43%范圍內(nèi),但區(qū)域測序深度分布有所差異。其中中華園田螺測序深度較高,在20～40×區(qū)域深度分布比較集中,其次分別是湄公螺(18～25×)、多棱角螺(10～38×)、銅銹環(huán)棱螺(10～20×)。4種田螺科貝類均為1個(gè)主峰,說明無外源污染。

2.4 田螺科4種貝類SSR特征分析

對(duì)中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺等4種貝類初步組裝的基因組,通過微衛(wèi)星識(shí)別工具M(jìn)ISA軟件對(duì)組裝基因組的Scaffolds進(jìn)行SSR分析。4種貝類總共分別搜索到 928 562、824 342、739 299、739 407個(gè)SSR。其中,4種貝類分別有 196 158、127 288、158 667、160 694條序列包含1個(gè)以上堿基重復(fù);分別有13 360、127 897、118 293、118 258 個(gè)復(fù)合形式存在。4種貝類SSR位點(diǎn)的核苷酸重復(fù)類型可劃分6種類型。其中,單核苷酸重復(fù)的SSR基元類型最豐富,五核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)基元類型和分布相對(duì)較少。具體而言,中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺的單核苷酸重復(fù)、雙核核苷酸重復(fù)序列占比最高,分別達(dá)79.2%、79.9%、78.7%、80.9%(表4)。對(duì)檢測出的重復(fù)基元進(jìn)行排序,其中,4種貝類優(yōu)勢重復(fù)基元分別是A/T、AC/GT、AAT/ATT、AGAT/ATCT、ATAAT/ATTAT、CTAACC/GGTTAA。對(duì)雙核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)中基元進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),4種貝類的優(yōu)勢重復(fù)基元大體相同(圖3)。

表4 田螺科4種螺基因組SSR類型

3 結(jié)論與討論

近年來,隨著測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的軟體動(dòng)物基因組被解析,為研究軟體動(dòng)物起源、進(jìn)化、生殖、發(fā)育、性別調(diào)控和免疫等問題提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。目前基因組調(diào)研的主要手段是高通量二代測序技術(shù)。本研究通過Illumina數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)手段,首次對(duì)腹足綱淡水軟體動(dòng)物田螺科貝類中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺等代表性物種的基因組大小、雜合度進(jìn)行評(píng)估分析。4種貝類的基因組大小分別為1 353、896、991、1 196 Mb,說明田螺科物種基因組大小存在差異,但與已公布大多數(shù)腹足綱物種的基因組大小接近[19-21]。腹足綱軟體動(dòng)物基因組大小存在豐富的多樣性,如在已測腹足綱中,基因組最大的物種是地中海芋螺(Conusventricosus),基因組大小為 3.6 G;霸王蓮花青螺(Lottiagigantea)基因組最小(359.5 Mb)[8],這2個(gè)物種基因組大小差異約為10倍?；蚪M是反映生物物種遺傳信息的重要指標(biāo),在物種進(jìn)化和適應(yīng)中起著重要作用,其大小與生物參數(shù)有關(guān),如細(xì)胞大小、抗逆性和個(gè)體生長等。在本研究中,田螺科貝類生長個(gè)體大小與基因組大小沒有直接的相關(guān)性。

前人將一個(gè)物種雜合度高于0.5%定義為高雜合度物種[22],在本研究中,中華園田螺、銅銹環(huán)棱螺、多棱角螺、湄公螺4種貝類的雜合度分別約0.77%、1.35%、2.41%、0.91%,均大于0.5%,說明這4種田螺科貝類是高雜合率物種,這可能與田螺科物種的特殊性有關(guān)。田螺科貝類屬于雌雄異體,且生境基本相同,不同種群間基因交流可能是造成雜合率高的原因之一。這在Wang等應(yīng)用線粒體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的研究中有所顯示[23],說明田螺科存在著種間基因交流,而部分種間是否存在生殖隔離還存在爭議,需要進(jìn)一步研究。實(shí)踐證明,高雜合度基因組會(huì)導(dǎo)致組裝過程中同源區(qū)域的read無法合并,分支結(jié)構(gòu)過多,連續(xù)性降低,從而造成組裝的基因組偏大。在本研究中也存在這樣的問題,應(yīng)用二代測序數(shù)據(jù)從頭組裝結(jié)果大小均高于應(yīng)用K-mer評(píng)估的結(jié)果。另外,高雜合還導(dǎo)致組裝結(jié)果中Contig N50較小,造成GC平均深度及分布較小。以上結(jié)果說明高雜合度提高了對(duì)田螺科物種精細(xì)基因圖譜的構(gòu)建難度。在本研究中4個(gè)田螺科物種重復(fù)序列占全基因組較小,分別為26.2%、26.7%、27.8%、28.8%,與已發(fā)表的其他腹足綱物種接近[24-26],為低重復(fù)序列基因組(重復(fù)序列比例高于50%是高重復(fù)基因組)[27],但非洲大蝸牛(Achatinafulica)例外,其重復(fù)序列比例較大,占整個(gè)基因組的70%,前人研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生基因組復(fù)制事件[28]。本研究4個(gè)田螺科貝類基因組重復(fù)序列占比較小,推測較少發(fā)生全基因組復(fù)制事件。

物種GC比例是評(píng)估、分析物種調(diào)研圖準(zhǔn)確度,評(píng)估后續(xù)基因組圖譜組裝難度的重點(diǎn)衡量標(biāo)準(zhǔn)之一[29]。在本研究中,田螺科4種貝類的GC含量分別為33.4%、33.7%、33.1%、33.8%,腹足綱其他物種GC含量在26.8%～45.5%的區(qū)間內(nèi),其中綠唇鮑(Haliotislaevigata)GC含量最小(26.8%)[30],印度洋熱液噴口蝸牛(Alviniconchamarisindica)最大(GC含量為45.5%)[31]。事實(shí)上腹足綱物種線粒體基因組中也有存在GC含量較低的規(guī)律,如福壽螺(Pomaceacanaliculata)、斑點(diǎn)果瓶螺(P.maculat)和皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)的線粒體GC含量在33%～40%范圍內(nèi)[32],說明腹足綱物種核基因組和線粒體基因組均具有AT偏好性。研究發(fā)現(xiàn)物種在基因組圖譜構(gòu)建中,過高或過低的GC含量將導(dǎo)致測序錯(cuò)誤,GC貧乏或富集區(qū)通常會(huì)引起擴(kuò)增效果較差,并影響組裝數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[33],且對(duì)準(zhǔn)確度的干擾高于完整性。這也是本研究4個(gè)貝類物種中基因組初步組裝質(zhì)量較差,以及其他貝類基因組序列組裝難度較高的因素之一[34]。

SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、等位差異顯著的優(yōu)點(diǎn)[35],是遺傳研究中應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記[36-37]。本研究利用MISA分析方法對(duì)田螺科代表性4種螺進(jìn)行SSR特征分析,與植物的SSR主要是雙核苷酸和三核苷酸不同[22],本研究4種貝類中單、雙核核苷酸重復(fù)序列占比最高,分別達(dá)79.2%、79.9%、78.7%、80.9%,這與扁玉螺(Neveritadidyma)[35]、泥東風(fēng)螺(Babylonialutosa)[38]的研究結(jié)果相一致。從4種田螺科貝類的SSR重復(fù)基元來看,單核苷酸中SSR位點(diǎn)占比最多的為A/T,雙核苷酸重復(fù)基元中,AC/GT占比均最高,這與前人研究的結(jié)果[39]相一致。SSR的長度會(huì)影響其本身多態(tài)性,而4種螺所含SSR的長度絕大部分在10～24 bp 之間的,分別占71.4%、64.9%、68.4%、70.2%,推測田螺科物種可能受到強(qiáng)烈的趨同選擇壓力。本研究為田螺科物種基因圖譜構(gòu)建、物種分子鑒定提供了前期基礎(chǔ)。