趙 鑫 楊 靜 辛向陽

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是工作年齡人群失明的主要原因[1]。DR發(fā)生機制被認為是高血糖通過多種生化機制促進血管功能障礙和神經(jīng)炎癥,這些生化機制包括增加細胞因子和生長因子表達、激活氧化應(yīng)激、激活多元醇途徑、增加晚期的糖基化和脂氧化終產(chǎn)物、導致血流動力學變化及白細胞停滯等[2-3]。微小核糖核酸(miRNA)是一類廣泛存在于動物界的轉(zhuǎn)錄后基因抑制因子家族,廣泛參與各種環(huán)境中基因表達的調(diào)控[4]。miRNA在DR中具有明顯的分化表達,對DR的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[5-7]。miR-224-5P在正常人體組織中多處表達,其異常表達與許多疾病相關(guān)。前期的多項研究表明,miR-224-5P是肝細胞癌[8]、胰腺導管腺癌[9]及非小細胞肺癌[10]等腫瘤性疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。在眼部疾病中,miR-224-5P通過靶向葡萄膜黑色素瘤中PIK3R3/AKT3 抑制細胞的增殖、遷移和侵襲[11];LncRNA PLCD3-OT1可以作為CeRNA通過海綿miR-224-5P和調(diào)節(jié)PLCD3的表達來預(yù)防年齡相關(guān)性白內(nèi)障[12]。而對miR-224-5P在DR中的表達變化及在DR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用研究較少。因此,本研究聚焦miR-224-5P在DR中的作用,探討miR-224-5P對DR發(fā)生發(fā)展的影響,分析該作用是否與JAK/STAT信號通路有關(guān),為DR的診斷和治療提供新的途徑和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本選取2021年6月至2022年3月在內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院眼科確診為DR的患者及同期來我院體檢中心體檢的健康人群各6例,采集納入研究者的空腹肘靜脈血各5 mL,放入-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩R患者年齡55～80(66.0±8.4)歲,其中男2例,女4例,糖尿病病程為6～30(16.2±8.8)年;健康人群年齡42～76(63.0±11.8)歲,其中男3例,女3例。DR患者與健康人群的年齡及性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.623、0.083)。DR患者納入標準:(1)所有研究對象長期居住于本地;(2)年齡為55～80歲。排除標準:(1)伴有除糖尿病外的其他嚴重的全身性疾病者;(2)合并有青光眼、葡萄膜炎、黃斑變性等其他眼部疾病者。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則,并經(jīng)內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院倫理委員會批準(批號:2021MER-041)。納入研究者均知情同意,并已簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與主要實驗試劑人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)購自上海雅吉公司;RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及反轉(zhuǎn)錄引物均由上海生工生物工程有限公司提供;慢病毒、質(zhì)粒及siRNA的構(gòu)建均由上海華大公司提供;LipofectamineTM3000試劑盒由美國Invitrogen公司提供;CCK-8試劑盒及Transwell試劑盒由美國Corning公司提供;Promega Dual-Luciferase system試劑盒由美國Promega公司提供;一抗、二抗試劑由英國Abcam公司提供;ELISA試劑盒由上海聯(lián)邁公司提供。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測血液中miR-224-5P表達情況DR患者和健康人群空腹外周血解凍后,Trizol法抽提總RNA,將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照 95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s,40個循環(huán)進行PCR擴增,通過2-△△CT法對外周血中miR-224-5P的表達情況進行分析。引物序列:miR-224-5P上游引物為5’-GGT CCT AAG TCA CTA GTG GTT CCG T T-3’,下游引物為5’-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3’;內(nèi)參基因U6上游引物為5’-CGC ACT TTA CGG CTA CCT CT-3’;下游引物為5’-CGC CCC AGA CTG AAA AAG AC-3’。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組處理ARPE-19細胞使用含體積分數(shù)10%FBS和10 g·L-1青鏈霉素的專用完全培養(yǎng)基,于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞隨機分組為高糖組、高糖+miR-224-5P mimics組和高糖+miR-224-5P inhibitor組。其中,高糖組:細胞用含30 mmol·L-1高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;高糖+miR-224-5P mimics組和高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞使用100 nmol·L-1LipofectamineTM3000 分別將100 nmol·L-1miR-224-5P mimics或100 nmol·L-1miR-224-5P inhibitor轉(zhuǎn)染至細胞中,6 h后置于含30 mmol·L-1的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。

另外,將正常培養(yǎng)的ARPE-19細胞隨機分成高糖組、高糖+miR-224-5P mimics組、高糖+OE-IL6ST組和高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組來驗證miR-224-5P mimics是否通過IL6ST/JAK/STAT通路發(fā)揮作用。其中,高糖+OE-IL6ST組和高糖+ miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組使用100 nmol·L-1LipofectamineTM3000 分別將100 nmol·L-1OE-IL6ST或100 nmol·L-1miR-224-5P mimics和100 nmol·L-1OE-IL6ST轉(zhuǎn)染至細胞中,6 h后置于含30 mmol·L-1的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活力將ARPE-19細胞按照每孔2×103個接種到96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,分組處理后向每孔中加10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中孵育5 d,分別于孵育1 d、2 d、3 d、4 d及5 d的同一時間點用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。每組設(shè)置2個復孔,實驗重復3次,取平均值統(tǒng)計。

1.2.4 Transwell細胞遷移實驗在24孔板中放入小室,加100 μL無血清培養(yǎng)基到小室內(nèi),培養(yǎng)箱放置2 h后移去培養(yǎng)基。加600 μL含體積分數(shù)20% FBS培養(yǎng)基到下室內(nèi)。胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的各組細胞,用含體積分數(shù)2% FBS的低血清培養(yǎng)基重懸,用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液,使每孔接種細胞數(shù)為50×103個,每個小室中加細胞懸液100 μL。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。棉拭子輕輕移去未轉(zhuǎn)移細胞,室溫下40 g·L-1多聚甲醛固定20 min。用400 μL吉姆薩染色 5 min,去離子水適度漂洗,倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 雙熒光素酶實驗驗證miR-224-5P與IL6ST的靶向關(guān)系通過Targetscan(http://www.targetscan.org)及MiRWALK網(wǎng)站(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)預(yù)測miR-224-5P可能的靶基因,并從中挑選IL6ST為候選靶基因進行實驗驗證。構(gòu)建IL6ST基因野生型(wt)及突變型(mut)質(zhì)粒載體,使用pcDNA3.1編碼螢火蟲熒光素酶,phRG編碼海腎熒光素酶為陰性對照。將HEK-293T細胞和目的質(zhì)粒分別加入96孔板,在細胞密度達到 50%～70%時使用0.3 μL LipofectamineTM3000進行細胞轉(zhuǎn)染。實驗分為陰性對照+IL6ST wt組(轉(zhuǎn)染1 pmoL陰性對照及0.1 μg IL6ST-3’UTR-wt)、miR-224-5P mimics+ IL6ST wt組(轉(zhuǎn)染1 pmoL miR-224-5P mimics及0.1 μg IL6ST-3’UTR-wt)、 陰性對照+IL6ST mut組(轉(zhuǎn)染1 pmoL陰性對照及0.1 μg IL6ST-3’UTR-mut)、miR-224-5P mimics+IL6ST mut(轉(zhuǎn)染1 pmoL miR-224-5P mimics及0.1 μg IL6ST-3’UTR-mut)4組。轉(zhuǎn)染48 h后,各組細胞分別取出25 μL置于96孔板中(每孔1×105個細胞),加入Dual-Glo?Reagent 75 μL室溫靜置10 min,測定Firefly luciferase值為報告基因發(fā)光值;加入75 μL Stop &Glo?Reagent,室溫靜置10 min后測定Renilla luciferase值為內(nèi)參值。統(tǒng)計分析相對熒光值變化,明確miR-224-5P 對 IL6ST的調(diào)控作用。

1.2.6 RT-qPCR檢測各組細胞IL6ST基因的內(nèi)源性表達各組細胞用Trizol法抽提總RNA,質(zhì)控后將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測各組細胞中IL6ST相對表達量。引物序列:IL6ST上游引物為5’-ACG AAT GGC AGC ATA CAC-3’,下游引物為5’-AGC AAA CAG GCA CGA CTA-3’;GAPDH上游引物為5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’,下游引物為5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’。

1.2.7 Western blot檢測各組細胞IL6ST、P-JAK及P-STAT蛋白相對表達高糖組、高糖+miR-224-5P mimics組、高糖+miR-224-5P inhibitor組、高糖+OE-IL6ST組和高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組細胞加160 μL細胞裂解液進行總蛋白的抽提,BCA法進行總蛋白定量。采用Western blot法以GAPDH為內(nèi)參,檢測各組細胞IL6ST、P-JAK及P-STAT蛋白表達水平,使用ImageJ行定量計算。

1.2.8 ELISA檢測各組細胞IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平將100 μL標準品及高糖組、高糖+miR-224-5P mimics組和高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞加入反應(yīng)孔中,封板后于37 ℃孵箱孵育90 min,分別加入100 μL生物素化抗體工作液、100 μL酶結(jié)合物工作液封板孵育60 min及30 min,再加入100 μL顯色底物至反應(yīng)孔中,封板后于37 ℃避光顯色15 min,加入50 μL終止液后即刻用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD),通過標準曲線計算樣品中IL-1β、IL-6 及TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1 DR患者及健康人群外周血中miR-224-5P的相對表達量比較RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,DR患者外周血中miR-224-5P mRNA相對表達量為0.421±0.079,顯著低于健康人群(0.973±0.249),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.2 miR-224-5P對細胞活力及遷移的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示,與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics組細胞活力增高,高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞活力降低(P<0.001)(圖1)。Transwell實驗結(jié)果顯示,高糖組、高糖+miR-224-5P mimics組、高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞遷移率分別為1.000%±0.080%、2.480%±0.059%、0.590%±0.053%,高糖+miR-224-5P mimics組細胞遷移率較高糖組明顯升高(P<0.001),高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞遷移率較高糖組明顯降低(P<0.001)。

圖1 各組ARPE-19細胞活力

2.3 miR-224-5P與IL6ST的靶向關(guān)系驗證通過軟件預(yù)測miR-224-5P與IL6ST之間有結(jié)合位點(圖2)。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示,miR-224-5P mimics+ IL6ST wt組細胞相對熒光素酶活性(0.006±0.000)低于陰性對照+IL6ST wt組(0.011±0.000)(P<0.001),miR-224-5P顯著下調(diào)野生型熒光素酶活性的表達,提示兩者間存在結(jié)合作用。突變后, miR-224-5P mimics+IL6ST mut組細胞相對熒光素酶活性(0.009±0.000)與陰性對照+IL6ST mut組(0.011±0.000)相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示miR-224-5P不能下調(diào)突變型熒光素酶活性的表達,突變成功后兩者間不存在結(jié)合作用。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,與陰性對照+IL6ST wt組(1.003±0.093)相比,miR-224-5P mimics+IL6ST wt組細胞的IL6ST mRNA表達水平(0.408±0.070)顯著降低(P<0.001),進一步驗證miR-224-5P 與IL6ST 的相互作用關(guān)系。

圖2 miR-224-5P在IL6ST mRNA 3’UTR的結(jié)合位點及突變位點示意圖

2.4 miR-224-5P對IL6ST、P-JAK及P-STAT蛋白表達水平的影響Western blot檢測結(jié)果顯示,與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics組細胞的IL6ST蛋白表達水平降低,P-JAK和P-STAT蛋白表達水平升高(均為P<0.05);高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞的IL6ST蛋白表達水平升高,P-JAK和P-STAT蛋白表達水平降低(均為P<0.05)(圖3)。

圖3 各組ARPE-19細胞的IL6ST、P-JAK和P-STAT蛋白表達 與高糖組相比,*P<0.05,**P<0.01。

2.5 miR-224-5P對IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平的影響ELISA檢測結(jié)果顯示,與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics組細胞的IL-1β、IL-6 及TNF-α蛋白表達水平均顯著降低,而高糖+miR-224-5P inhibitor組細胞的IL-1β、IL-6 及TNF-α蛋白表達水平均顯著上升(均為P<0.01)(圖4)。

圖4 各組ARPE-19細胞炎癥因子的表達情況 與高糖組相比,**P<0.01,***P<0.001。

2.6 過表達IL6ST可以逆轉(zhuǎn)miR-224-5P對高糖誘導ARPE-19細胞的影響CCK-8和Transwell檢測結(jié)果顯示:高糖組、高糖+miR-224-5P mimics組、高糖+OE-IL6ST組和高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組ARPE-19細胞活力分別為2.634%±1.142%、3.186%±1.525%、1.938%±0.629%、2.699%±1.198%,細胞遷移率分別為0.990%±0.020%、1.390%±0.024%、0.440%±0.016%、0.480%±0.020%。與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics組細胞活力和細胞遷移率均顯著升高,高糖+OE-IL6ST組細胞活力和細胞遷移率均顯著降低(均為P<0.001);與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組細胞活力升高,細胞遷移率降低(均為P<0.001);高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組細胞活力和遷移率均較高糖+miR-224-5P mimics組顯著降低(均為P<0.001)。Western blot檢測結(jié)果顯示,與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics組細胞的P-JAK和P-STAT蛋白表達水平均升高(均為P<0.05);高糖+OE-IL6ST組細胞的P-JAK和P-STAT蛋白表達水平均顯著降低(均為P<0.001);與高糖組相比,高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組細胞的P-JAK和P-STAT蛋白表達水平均降低(均為P<0.001);與高糖+OE-IL6ST組相比,高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組細胞的P-JAK和P-STAT蛋白表達水平均升高(均為P<0.001);與高糖+miR-224-5P mimics組相比,高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組細胞的P-JAK和P-STAT蛋白表達水平均降低(均為P<0.001)(圖5)。

圖5 過表達IL6ST對各組ARPE-19細胞的IL6ST、P-JAK和P-STAT蛋白表達的影響

3 討論

DR是與持續(xù)高血糖相關(guān)的一種慢性、進行性、潛在危害視力的視網(wǎng)膜微血管疾病,其發(fā)生的分子機制錯綜復雜,涉及氧化應(yīng)激、炎癥、新生血管、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡和膠質(zhì)細胞活性的改變等[13]。有研究發(fā)現(xiàn),microRNA在DR中可以調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激及神經(jīng)變性這幾種病理過程的分子相互作用和信號通路[14]。Becker等[15]研究顯示,miR-224-5P是與DR相關(guān)的重要RNA分子,在DR患者死后視網(wǎng)膜樣本中富集并顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn),miR-224-5P 在DR患者血液中表達顯著低于健康對照人群,提示miR-224-5P可能參與調(diào)控DR的發(fā)生發(fā)展。

視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)是神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜區(qū)域之間的單層細胞屏障,可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜營養(yǎng)物質(zhì)代謝、分泌生長因子促進視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜生長、吞噬衰老的感光細胞外膜[16]。有研究顯示,在高糖誘導的ARPE-19細胞中,miR-455-5P可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子及轉(zhuǎn)化生長因子顯著增強細胞活力[17]。本實驗以miR-224-5P過表達/抑制質(zhì)粒干預(yù)處理高糖誘導的ARPE-19細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達miR-224-5P可增加細胞活力和遷移率,而抑制miR-224-5P后細胞活力和遷移率降低,提示miR-224-5P可以增加高糖誘導的ARPE-19細胞活力及遷移率,也許可以成為DR的治療靶點。

DR的發(fā)生已經(jīng)證實與炎癥有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示,過表達miR-224-5P可降低高糖誘導的ARPE-19細胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α的表達,而抑制miR-224-5P可增加上述炎癥因子表達,表明miR-224-5P可以抑制DR的炎癥反應(yīng)。本研究進一步探究了miR-224-5P可能的作用機制。經(jīng)典JAK/STAT信號通路是細胞功能的中心通訊節(jié)點之一,在視網(wǎng)膜的損傷和再生反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖以及星形膠質(zhì)細胞的分化、視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的損傷過程中是一個重要信號“樞紐”[19],在DR發(fā)病中也有重要作用。IL6ST是一種信號受體亞基,編碼膜糖蛋白130 (GP130),作用于IL-6家族細胞因子[20]。IL6ST能通過JAK-STAT途徑轉(zhuǎn)導,其中受體相關(guān)JAK(即JAK1、JAK2和TYK2)激活潛在轉(zhuǎn)錄因子STAT1、STAT3和STAT5的募集和活化[21]。研究發(fā)現(xiàn),IL-6/JAK/STAT3信號通路與許多炎癥性疾病和癌癥有關(guān)[22]。同時,部分研究已證明,IL-6/JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑也通過與細胞miRNA的復雜相互作用發(fā)揮作用[23]。本研究通過雙熒光素酶實驗證實了IL6ST是miR-224-5P調(diào)控的靶基因,并且與陰性對照組相比,過表達miR-224-5P后IL6ST的mRNA表達水平顯著降低,兩者呈負相關(guān),說明miR-224-5P可以通過負調(diào)控IL6ST影響DR進程。我們進一步探究了miR-224-5P是否通過IL6ST/JAK/STAT信號通路在高糖誘導的ARPE-19細胞中發(fā)揮作用。結(jié)果顯示,過表達miR-224-5P降低IL6ST的蛋白水平,而增加了下游分子P-JAK和P-STAT蛋白水平。抑制miR-224-5P使IL6ST的蛋白表達水平升高,P-JAK和P-STAT的蛋白水平下降。通過過表達IL6ST進一步驗證發(fā)現(xiàn),與高糖+miR-224-5P mimics組相比,高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST組ARPE-19細胞活力和細胞遷移率均顯著降低,且P-JAK和P-STAT的蛋白表達水平降低。這表明miR-224-5P在高糖誘導的ARPE-19細胞中是通過活化IL6ST/JAK/STAT信號通路發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果中P-JAK和P-STAT的蛋白表達水平變化,與Fiebelkow等[24]研究認為的IL-6受體激活JAK/STAT信號通路引起的P-JAK和P-STAT的蛋白表達水平變化不同。Darnell等[25]研究顯示,50多種細胞因子和生長因子可以作用于JAK/STAT信號通路引起P-JAK和P-STAT的蛋白表達水平發(fā)生變化,本實驗研究結(jié)果可能是由于多種細胞因子綜合作用表現(xiàn)出的結(jié)果,詳細機制有待后續(xù)進一步研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),miR-224-5P在DR患者血液中表達降低,過表達miR-224-5P可降低高糖引起的炎癥因子表達,并可通過IL6ST/JAK/STAT信號通路增加高糖誘導的ARPE-19細胞活力及遷移率,從而調(diào)控DR的發(fā)生和發(fā)展。后續(xù)我們將進一步研究miR-224-5P增加RPE細胞活力及遷移率對DR的可能作用,并驗證其他miRNA在DR發(fā)生發(fā)展中的具體表達機制,為DR的分子標記物研究提供新的思路和依據(jù)。