周科 向杰 張長江 張莉

[摘要]?目的?篩選心房顫動（atrial?fibrillation，AF）促纖維化的關(guān)鍵基因及信號通路，探討AF誘導(dǎo)的人心房成纖維細胞的促纖維化重塑的分子機制。方法?從公共基因數(shù)據(jù)庫（gene?expression?omnibus，GEO）下載單細胞RNA序列表達譜GSE148506，通過主成分分析和T分布式隨機鄰接嵌入得到差異基因，利用SingleR軟件包進行細胞類型注釋和軌跡分析，使用clusterprofiler軟件包，對成纖維細胞的差異基因進行基因本體（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genome，KEGG）信號通路分析。利用在線STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和模塊分析。利用插件cytoHubba篩選出關(guān)鍵基因。結(jié)果?共得到6個細胞類型注釋群，包括成纖維細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、單核細胞、成纖維細胞、骨骼肌細胞。共鑒定出367個成纖維細胞差異基因，包括37個下調(diào)基因和330個上調(diào)基因。GO功能富集分析結(jié)果顯示，成纖維細胞的差異基因生物過程主要富集于細胞外基質(zhì)組織等；細胞組成主要富集于含膠原細胞外基質(zhì)等；分子功能主要富集于細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等。KEGG信號通路分析表明，差異基因主要富集于黏著斑、細胞外基質(zhì)-受體相互作用等。STRING分析從蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖中鑒定出6個成纖維細胞關(guān)鍵基因，即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN。結(jié)論?利用生物信息學(xué)分析，鑒定出FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN在內(nèi)的基因及黏著斑、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白酶信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路可能是AF誘導(dǎo)的人心房成纖維細胞促纖維化重塑的重要分子機制。

[關(guān)鍵詞]?心房顫動；單細胞RNA序列；人心房成纖維細胞；生物信息學(xué)分析

[中圖分類號]?R541.7??????[文獻標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.09.001

Bioinformatics?analysis?of?single-cell?RNA-seq?of?atrial?human?fibroblasts?with?atrial?fibrillation

ZHOU?Ke，?XIANG?Jie，?ZHANG?Changjiang，?ZHANG?Li

Cardiology?Department，?Affiliated?Minda?Hospital?of?Hubei?Minzu?University，?Enshi?445000，?Hubei，?China

[Abstract]?Objective?To?screen?key?genes?and?signaling?pathways?for?pro-fibrosis?in?atrial?fibrillation?（AF）?and?explore?the?molecular?mechanisms?of?AF-induced?pro-fibrotic?remodeling?in?human?atrial?fibroblasts.?Methods?Single-cell?RNA-seq?（scRNA-seq）?expression?profile?GSE148506?（AF?and?SR?fibroblasts），?was?downloaded?from?the?gene?expression?omnibus?（GEO）?database.?The?marker?genes?were?obtained?by?quality?control?and?data?filtering，?principal?component?analysis?and?t-distributed?stochastic?neighbor?embedding.?SingleR?package?was?utilized?for?cell?type?annotation?and?trajectory?analysis.?By?using?the?clusterprofiler?package，?the?marker?genes?of?fibroblasts?were?performed?through?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes?（KEGG）?pathway?analysis.?Protein-protein?interaction?network?analysis?and?module?analysis?was?performed?using?the?STRING?database?and?Cytoscape?software.?The?hub?genes?were?screened?out?by?utilizing?the?plug-in?cytoHubba.?Results?6?clusters?of?cell?type?annotations?were?obtained，?included?fibroblasts，?adipocytes，?endothelialcells，?monocytes，?fibroblasts，?skeletal?muscle.?A?total?of?367?fibroblasts?marker?genes?were?identified，?included?37?down-regulated?and?330?up-regulated?genes.?GO?functional?enrichment?analysis?results?showed?that?the?marker?genes?for?fibroblasts?were?predominantly?enriched?for?extracellular?matrix?organization?for?biological?process;?collagen-containing?extracellular?matrix?for?cellular?component;?and?extracellular?matrix?structural?constituent?for?molecular?function.?KEGG?pathway?analyses?indicated?that?the?marker?genes?were?meaningfully?enriched?in?Focal?adhesion，?extracellular?matrix?（ECM）-receptor?interaction，?and?so?on.?Top?6?hub?genes?of?fibroblasts?included?FN1，?TIMP1，?LAMB1，?FBN1，?C3，?VCAN.?Conclusion?Using?bioinformatics?analysis，?we?identified?genes?including?FN1，?TIMP1，?LAMB1，?FBN1，?C3?and?VCAN?and?Focal?adhesion，?ECM-receptor?interactions，?PI3K-AKT?signaling?pathway?and?transforming?growth?factor-β?signaling?pathway?as?possible?important?molecular?mechanisms?of?pro-fibrotic?remodeling?in?human?atrial?fibroblasts?in?AF.

[Key?words]?Atrial?fibrillation;?Single-cell?RNA-seq;?Atrial?human?fibroblasts;?Bioinformatics?analysis

心房顫動（atrial?fibrillation，AF）是臨床上常見的心律失常類型之一，其發(fā)病率的增加與許多因素有關(guān)，如高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等，導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)的改變，從而增加對AF的易感性[1]。目前觀點認為，心房纖維化會刺激心房結(jié)構(gòu)的重塑，從而導(dǎo)致AF的發(fā)生和維持[2]。研究表明，AF患者纖維組織的含量和分布與AF發(fā)生的機制、并發(fā)癥和治療失敗的風(fēng)險有關(guān)[3]。成纖維細胞被認為是心肌中豐富的非肌細胞群，它控制著細胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)[4]。成纖維細胞占心臟細胞數(shù)量的75%，但僅占其質(zhì)量的10%～15%[5]。因此，通過成纖維細胞可更好地了解AF發(fā)生、發(fā)展的分子機制并發(fā)現(xiàn)抗心律失常干預(yù)的新靶點。單細胞RNA測序（single-cell?RNA-seq，scRNA-seq）可在細胞分子水平上全面分析AF的發(fā)生機制，AF的遺傳學(xué)非常復(fù)雜，罕見和常見的突變均會增加對AF的易感性[6]。盡管許多研究已通過微陣列分析獲得與AF相關(guān)的潛在基因和通路，但目前對AF患者成纖維細胞scRNA-seq的研究較少。本研究通過成纖維細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，利用AF和竇性心律（sinus?rhythm，SR）樣本的成纖維細胞以評估AF中的差異基因和潛在信號通路，現(xiàn)報道如下。

1??材料與方法

1.1??scRNA-seq數(shù)據(jù)

篩選公共基因數(shù)據(jù)庫（gene?expression?omnibus，geo）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中所有AF成纖維細胞的scRNA-seq表達數(shù)據(jù)集后，選擇GSE148506進行分析，它來自GPL18573平臺Illumina?NextSeq?500（Homo?sapiens），包括4個AF和4個SR的384個樣本的表達譜。

1.2??PCA和T-SNE分析

主成分分析（principal?component?analysis，PCA）和T分布式隨機鄰接嵌入（t-distributed?stochastic?neighbor?embedding，T-SNE）被用于數(shù)據(jù)的降維處理。由于原理和機制不同，T-SNE保留的屬性信息更具代表性，反映樣本間差異，但T-SNE速度較慢，PCA速度相對較快。

1.3??差異基因

經(jīng)T-SNE分析后得到不同聚類，將|log?（fold?change）|>2和P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)尋找每個聚類的差異基因。

1.4??細胞類型注釋和軌跡分析

SingleR是一種計算方法，將單細胞轉(zhuǎn)錄組與參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集相關(guān)聯(lián)，并迭代改進其推斷，可用于改進scRNA-seq中的細胞類型注釋。Monocle工具被用于分析細胞分化軌跡，以轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，使用模型預(yù)測細胞進化/分化過程。

1.5??GO和KEGG通路富集分析

使用R軟件包Clusterprofler比較基因簇之間的生物學(xué)特性，利用其進行基因本體（gene?ontology，?GO）分析探討差異基因的生物學(xué)功能，并進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）通路分析以確定差異基因富集的信號通路。

1.6??蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用在線STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）預(yù)測差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，相互作用論證的最高置信度設(shè)定>0.7。利用Cytoscape（3.7.1版）軟件對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析。通過使用cytoHubba插件最大克里爾中心度和度識別關(guān)鍵基因，包括利用Cytoscape軟件的分子復(fù)合體檢測（molecular?complex?detection，MCODE）插件尋找整個網(wǎng)絡(luò)的模塊，參數(shù)設(shè)置：度值=2，節(jié)點得分值=0.2，k-core=2，最大深度=100。

2??結(jié)果

2.1??PCA和T-SNE分析

經(jīng)PCA分析得到一系列主成分（principal?component，PC），見圖1。實際PC關(guān)鍵基因與理論基因的差異顯示見圖2。選擇前20個PC進行T-SNE分析，得到6個聚類。不同細胞群中基因的表達情況見圖3。各聚類中6個關(guān)鍵基因表達水平的小提琴圖見圖4A；T-SNE中6個關(guān)鍵基因表達水平的散點圖見圖4B；各聚類中6個關(guān)鍵基因表達水平的氣泡圖見圖4C。關(guān)鍵基因的表達主要集中在聚類0和4，選擇聚類0和4（成纖維細胞群）的差異基因進行分析。

2.2??細胞類型注釋和軌跡分析

共得到6個聚類的細胞類型。聚類0，成纖維細胞；聚類1，脂肪細胞；聚類2，內(nèi)皮細胞；聚類3，單核細胞；聚類4，成纖維細胞；聚類5，骨骼肌細胞。6個聚類細胞類型的軌跡分析見圖5。

2.3??差異基因

聚類0中共鑒定出242個標(biāo)記基因，包括205個上調(diào)的差異基因和37個下調(diào)的差異基因；聚類4中共鑒定出125個上調(diào)的差異基因，聚類4中未篩選出下調(diào)的差異基因。

2.4??GO和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示，成纖維細胞的差異基因生物過程主要富集于細胞外基質(zhì)組織、細胞外結(jié)構(gòu)組織、結(jié)締組織；細胞組成主要富集于含膠原細胞外基質(zhì)、基底膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；分子功能主要富集于細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、糖胺聚糖結(jié)合、肝素結(jié)合。GO富集度前5位的基因及其相關(guān)基因見圖6A、6B。KEGG信號通路分析表明，差異基因主要富集于黏著斑、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、血管平滑肌收縮、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide?3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）信號通路（PI3K-AKT）、蛋白質(zhì)消化吸收等，前5個KEGG信號通路及其相關(guān)基因見圖6C、6D。

2.5??蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因和模塊分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫，創(chuàng)建一個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)探討這些差異基因的生物學(xué)特性，包含343個節(jié)點和786條邊。使用Cytoscape-cytoHubba插件，通過最大克里爾中心度和度值的方法篩選出6個關(guān)鍵基因，即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3和VCAN。

3??討論

AF是一種日趨嚴重的臨床疾病，遺傳學(xué)特征復(fù)雜，罕見和常見的基因突變均可極大地增加AF的易感性。近年來生物信息學(xué)取得較大進步，隨著基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，基因芯片技術(shù)在心血管臨床和研究中得到廣泛應(yīng)用。因此，應(yīng)用生物信息學(xué)方法進一步探討AF的發(fā)病機制非常重要，有助于在遺傳水平上發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療AF的新靶點。本研究中，被鑒定出的關(guān)鍵基因和信號通路在AF的研究中已有少量報道，表明綜合生物信息學(xué)分析的結(jié)果具有重要作用。

結(jié)構(gòu)重塑、電重塑和收縮性重塑在AF的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用。結(jié)構(gòu)重塑取決于兩個部分：一是細胞結(jié)構(gòu)變化，二是細胞外基質(zhì)分布不平衡[7-8]。大量研究表明，AF的存在與細胞外基質(zhì)沉積和降解平衡關(guān)系的破壞與心房重塑之間存在著極大的相關(guān)性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要富集在與細胞外基質(zhì)有關(guān)的生物過程中。心肌成纖維細胞主要參與心肌重塑，單核細胞在心肌梗死誘發(fā)的炎癥期間的心臟重塑中也發(fā)揮重要作用[9]。此外，在炎癥和傷口愈合期間，誘發(fā)的心臟纖維化與單核細胞亞群有關(guān)，這些證據(jù)表明，單核細胞與AF密切相關(guān)[10]。根據(jù)細胞軌跡分析結(jié)果顯示，單核細胞和成纖維細胞相互毗鄰。金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue?inhibitor?of?metalloproteinases-1，TIMP-1）基因通過控制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinases，MMPs）的活性在細胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用。研究表明，血漿和組織中TIMP-1水平的升高與心肌纖維化和舒張功能障礙有著密切的聯(lián)系[11]。同時，TIMP-1對AF的病理生理學(xué)有重大影響，而這種影響是由MMPs和TIMPs間的不平衡所致[12]。Nakano等[13]發(fā)現(xiàn)MMP-9在AF患者的心房組織中高度表達，可能導(dǎo)致AF期間心房結(jié)構(gòu)重塑和心房擴張，因此，本研究結(jié)果進一步表明，TIMP-1/MMPs信號通路是治療AF心房重塑和纖維化的潛在目標(biāo)。

纖連蛋白1（fibronectin?1，F(xiàn)N1）屬于細胞外基質(zhì)的糖蛋白家族，廣泛存在于各種類型的細胞中，與細胞的黏附和遷移過程密切相關(guān)，通過整合素跨膜受體參與病理生理過程變化[14-15]。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化重塑和衰竭過程中，成纖維細胞的FN1表達顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1主要富集在黏著斑、細胞外基質(zhì)-受體相互作用和PI3K-AKT信號通路上，F(xiàn)N1通過影響PI3K/AKT信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)特性，通過阻斷PI3K-AKT的激活抑制FN1基因的表達，抑制細胞增殖，促進細胞衰老和凋亡，并減少細胞遷移和侵襲[17]。

通過KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白-1（fibrillin-1，F(xiàn)BN-1）明顯富集于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming?growth?factor-β，TGF-β）信號通路中。TGF-β被認為是心房纖維化的一個主要介質(zhì)，而TGF-β過度表達模型在體外或體內(nèi)研究心房纖維化和AF的發(fā)病機制已被廣泛認可[18-19]。

總之，利用AF和SR患者成纖維細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，確定與AF相關(guān)的差異表達基因，從而在基因水平上探討AF發(fā)生的機制。FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3和VCAN在內(nèi)的基因及黏著斑、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、PI3K-AKT信號通路和TGF-β信號通路有可能成為AF的新生標(biāo)志物，并可能成為AF的潛在治療目標(biāo)。

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