防脫發(fā)中藥復(fù)方提取物生物活性分析

樂純琰　高天問(wèn)　楊國(guó)蓉　賈鑫茹　丁濱　黃杰

【摘要】? 目的? 探究一個(gè)中藥復(fù)方提取物（至墨植萃粉，ZMD）防脫發(fā)，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的生物學(xué)機(jī)理。方法? 采用UPLC-MS/MS表征復(fù)方中的主要成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)ZMD的生物活性；分別用CCK-8試劑盒和BODIPY染色測(cè)定細(xì)胞增殖活性，并觀察脂滴形態(tài)；通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果? 質(zhì)譜表征得到了60多個(gè)化合物，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)這些化合物可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響毛囊周期；ZMD的乙酸乙酯部位（Peap）能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖、緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、防止脂質(zhì)蓄積，能上調(diào)Wnt10b、Wnt10a、β-catenin和AKT的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論? 洗發(fā)水中藥復(fù)方提取物中的乙酸乙酯部位是可以通過(guò)AKT途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，并可以通過(guò)p-AKT和Wnt10激活β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而延長(zhǎng)毛囊生長(zhǎng)期，達(dá)到防脫發(fā)的目的。

【關(guān)鍵詞】? UPLC-MS/MS；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；生物活性；Wnt/β-catenin 信號(hào)通路；AKT

中圖分類號(hào)? R285? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? ? 文章編號(hào)? 1671-0223（2023）01--04

最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)目前有2.5億脫發(fā)人群，平均每6個(gè)中國(guó)人中就有1個(gè)飽受脫發(fā)困擾，且26～30歲是脫發(fā)的“高發(fā)”年齡段[1]，占比高達(dá)84%，較上一代人的脫發(fā)年齡提前了20年。脫發(fā)的低齡化趨勢(shì)推動(dòng)了相關(guān)臨床防治和病理基礎(chǔ)的研究。脫發(fā)分為生理性和病理性兩類，生理性脫發(fā)是毛囊進(jìn)入休止期后正常的脫落現(xiàn)象，每天有100～150根毛發(fā)脫落則屬于毛囊生理周期的自然結(jié)果[2]；病理性脫發(fā)則是臨床上的一種皮膚疾病。臨床上常見的脫發(fā)類型有雄激素性脫發(fā)[3]、斑禿[4]、瘢痕性脫發(fā)[5]、藥物性脫發(fā)[6]、頭癬[7]、營(yíng)養(yǎng)不良脫發(fā)[8]等。由于病癥的嚴(yán)重程度及治療成本的差異，多數(shù)輕癥患者會(huì)選擇防脫發(fā)洗發(fā)水進(jìn)行治療。2019年7月，《消費(fèi)者報(bào)道》從京東、天貓兩個(gè)電商平臺(tái)收集了8款防脫洗發(fā)水的3.2萬(wàn)條消費(fèi)者評(píng)論數(shù)據(jù)，從消費(fèi)者評(píng)論數(shù)據(jù)來(lái)看，目前市場(chǎng)上洗發(fā)水在防脫效果上表現(xiàn)一般[9]。近年來(lái)，隨著防脫洗發(fā)水需求的快速增長(zhǎng)和一二線城市洗發(fā)水市場(chǎng)規(guī)模的迅速擴(kuò)大，以中藥成分為主打的防脫發(fā)洗發(fā)水已占據(jù)了洗護(hù)市場(chǎng)28%的份額[10]。

國(guó)醫(yī)大師禤國(guó)維教授以中醫(yī)藥治療雄激素性脫發(fā)頗具特色，強(qiáng)調(diào)肝腎不足為其發(fā)病之根本[11]，用加味二至丸平補(bǔ)肝腎治其本，涼血清熱治其標(biāo)[12]，療效顯著。本項(xiàng)目中的洗發(fā)水中藥復(fù)方就是在古方“二至丸”的基礎(chǔ)上添加首烏、桑葚、紅花等十幾味中藥材而制成。通過(guò)前期的試用反饋，有26.3%的受試者認(rèn)為該洗發(fā)水能夠緩解脫發(fā)。中藥復(fù)方提取物化合物成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，為科學(xué)地闡述該中藥復(fù)方防脫發(fā)的生物學(xué)機(jī)制，本研究對(duì)該洗發(fā)水中藥復(fù)方提取物的化合物組分、生物活性部位進(jìn)行初步探究。

1? 材料與方法

1.1? 材料和試劑

HaCaT細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；中藥復(fù)方提取物（至墨植萃粉，ZMD）由杭州至墨生物科技有限公司提供；其他生化及化學(xué)試劑、培養(yǎng)基、特異性抗體等分別購(gòu)自北京標(biāo)譜檢測(cè)科技有限公司、德國(guó)Merck公司、杭州高晟生物科技有限公司、賽默飛世爾科技公司和武漢博歐特生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2? 儀器與設(shè)備

本研究用到以下設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）；全波長(zhǎng)分光光度計(jì)（英國(guó)柏楉有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；Waters ACQUITY I-Class Plus UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)沃特斯公司）；SCIEX X-500R四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)AB SCIEX 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1? 中藥復(fù)方制備及化學(xué)成分分析

采用200ml 45%乙醇溶解25g ZMD，依次加入等體積的石油醚、乙酸乙酯（去除乙醇后）、水飽和正丁醇溶液進(jìn)行分級(jí)萃取，將分離得到的各萃取部位用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干備用。配制濃度為1mg/ml的中藥復(fù)方供試品溶液。設(shè)置色譜條件：流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫程序：0～2.7min，99% B；2.7～8 min，99%～68% B；8～28min，68%～45% B；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣盤溫度：8℃；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3μL。設(shè)置質(zhì)譜條件：飛行質(zhì)譜ESI正負(fù)粒子掃描模式，進(jìn)樣分析。根據(jù)化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布比和MS/MS搜索SCIEX OS配置的中藥二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)TCM MS/MS Library（包含1000多種中藥化合物二級(jí)數(shù)據(jù)），完成對(duì)目標(biāo)物的篩查。

1.3.2? 細(xì)胞模型的建立和指標(biāo)檢測(cè)

將細(xì)胞按1×104 個(gè)/孔接種到96孔板中，加入含有10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，分別用800μMH2O2、400μM油酸（OA）處理細(xì)胞構(gòu)建抗氧化和脂質(zhì)蓄積模型，用梯度濃度制備的復(fù)方各個(gè)部位處理不同模型，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性、BODIPY染料進(jìn)行細(xì)胞染色。

1.3.3? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選中藥的有效成分及相應(yīng)靶基因，構(gòu)建靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)；借助Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）尋找疾病基因；借助Venny 2.1.0平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得中藥復(fù)方活性成分與疾病的交集基因及韋恩圖；利用 Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建成化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行分析。

1.3.4? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

收集細(xì)胞，PBS洗3次后用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在八聯(lián)管中依次加入cDNA，雙蒸水，特異性引物和2X SYBR Green Mix，離心后放入熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃，5min；變性：94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，44個(gè)循環(huán)；延伸：72℃，5min。

1.3.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 復(fù)方活性部位的細(xì)胞模型評(píng)價(jià)

分別用濃度為10～100μg/ml的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇和水溶部位處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位（Peap）和正丁醇部位（Pwnp）有促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性（見圖1 A、B，陰性結(jié)果未展示）。在氧化應(yīng)激模型中，濃度為40、60、80μg/ml的Peap有顯著的緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的活性（P<0.01）（見圖1 C），而Pwnp未出現(xiàn)保護(hù)效果（見圖1 D）。在脂質(zhì)蓄積實(shí)驗(yàn)中，與Ctrl組比較OA處理后造成的脂質(zhì)蓄積明顯，Peap處理不會(huì)造成脂質(zhì)蓄積，而且能夠顯著清除OA模型細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積（見圖2）。

2.2? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

通過(guò)UPLC-MS對(duì)中藥復(fù)方Peap部位進(jìn)行初步表征分析后，得到正離子模式下中藥復(fù)方歸屬的化學(xué)成分31個(gè)，負(fù)離子模式下中藥復(fù)方歸屬的化學(xué)成分38個(gè)。對(duì)表征的化合物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理分析共獲得207個(gè)中藥復(fù)方潛在靶點(diǎn)，與652個(gè)脫發(fā)相關(guān)的疾病靶點(diǎn)對(duì)比，獲得34個(gè)中藥復(fù)方—疾病交集基因（見圖3）。將此34個(gè)共同靶點(diǎn)和中藥復(fù)方潛在靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.8.2軟件中繪制出“化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，圖中紅色代表疾病，藍(lán)色代表化合物，黃色代表34個(gè)共同靶點(diǎn)（見圖4）。將得到的34個(gè)交集基因借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行GO和KEGG分析，分別得到GO條目752個(gè)（P<0.05）和75條信號(hào)通路，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路高度聚焦。

2.3? RT-PCR檢測(cè)毛囊發(fā)育和細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

與Ctrl組相比，Peap（40、60μg/ml）處理極顯著上調(diào)了細(xì)胞中Wnt10b、Wnt10a、β-catenin、AKT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且低濃度效果較高濃度更明顯（見圖5）。

3? 討論

本研究中涉及的中藥復(fù)方提取物是一款防脫發(fā)洗發(fā)水中添加的主要活性成分，該復(fù)方由古方“二至丸”加味制成，目前尚未有對(duì)其防脫發(fā)的生物學(xué)機(jī)制的研究。經(jīng)過(guò)液質(zhì)聯(lián)用表征和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，我們推測(cè)弱極性部位可能是該復(fù)方提取物的主要活性部位，而作用靶點(diǎn)集中在誘導(dǎo)細(xì)胞分化的Wnt/β-catenin通路。我們用不同極性的溶劑將其進(jìn)行逐級(jí)萃取分離，得到了石油醚、乙酸乙酯（Peap）、水飽和正丁醇（Pwnp）和水相四個(gè)部位，細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Peap和Pwnp兩個(gè)部位有促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，而在氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中僅Peap（40～80 μg/ml）表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，因此在脂質(zhì)蓄積實(shí)驗(yàn)中我們僅對(duì)該部位的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)80μg/ml的Peap能夠顯著清除細(xì)胞中的脂質(zhì)蓄積。通過(guò)上述研究我們推測(cè)Peap的活性濃度在40～80μg/ml范圍內(nèi)。在接下來(lái)的研究中我們用RT-PCR方法證明了該濃度范圍Peap能調(diào)控Wnt/β-catenin通路。

大量研究證明，驅(qū)動(dòng)毛囊干細(xì)胞從靜止期進(jìn)入生長(zhǎng)期可以有效防止脫發(fā)，而Wnt/β-catenin途徑參與了該過(guò)程[13]，其中p-AKT促進(jìn)β-catenin的表達(dá)，從而使Wnt10a、Wnt10b的表達(dá)激增，進(jìn)而延長(zhǎng)毛囊生長(zhǎng)期[14]，而我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析也預(yù)測(cè)到Wnt/β-catenin可能是Peap的作用靶點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)用Peap處理細(xì)胞促進(jìn)了Wnt10a、Wnt10b和β-catenin表達(dá)，說(shuō)明Peap可能同時(shí)通過(guò)Wnt10和AKT兩個(gè)信號(hào)通路疊加促進(jìn)了β-catenin的表達(dá)。我們推測(cè)這與Peap中復(fù)雜的化學(xué)成分有關(guān)。因?yàn)锳KT是通過(guò)傳遞磷酸化信號(hào)發(fā)揮調(diào)控功能的，因此這并不影響細(xì)胞增殖活性[15]。

中醫(yī)認(rèn)為毛發(fā)的不正常脫落是體內(nèi)臟腑經(jīng)絡(luò)氣血的活動(dòng)失調(diào)所致[16-17]。腎主骨，生髓充腦，其華在發(fā)，發(fā)的生長(zhǎng)，賴血以養(yǎng)，故稱“發(fā)為血之余”[17]。當(dāng)代年輕人生活節(jié)奏快，工作壓力大，脫發(fā)病因多以肝腎陰虛為根本，加之不規(guī)律的飲食及生活習(xí)慣導(dǎo)致[17]。二至丸出自《扶壽精方》，由等質(zhì)量的女貞子和旱蓮草組合而成，女貞子采于冬至，而旱蓮草采于夏至，故名為二至丸[18]，具有補(bǔ)肝腎之陰的作用，在臨床上被廣泛用于肝腎陰虛所致的口苦咽干、失眠健忘、多夢(mèng)易醒、頭昏頭痛、腰膝酸軟、月經(jīng)不調(diào)、須發(fā)早白等癥[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，近年來(lái)二至丸（或加味二至丸）為臨床上治療脫發(fā)使用頻率較高的方劑[20]，且收效良好。但目前尚未有相關(guān)作用機(jī)制的研究，而我們的研究?jī)H僅是對(duì)加味二至丸防治脫發(fā)的生物學(xué)機(jī)制的初步探索。

4? 參考文獻(xiàn)

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[2022-04-08收稿]