周金劍,楊 康

(武漢大學人民醫(yī)院:1.麻醉科,2.泌尿外科,湖北武漢 430061)

腎缺血再灌注 (ischemia reperfusion,I/R)損傷是指腎組織短暫缺血后,恢復血供導致腎臟損傷程度加重的一種病理生理現(xiàn)象,臨床中常見于腎部分切除以及腎移植等過程。腎 I/R損傷是腎小管和炎癥細胞等多因素相互作用的炎癥反應[1]。調控核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)作為一類重要的核轉錄因子,在體內主要參與調控炎癥反應[2]。當腎臟發(fā)生I/R時,NF-κB信號通路關鍵蛋白P65將進入細胞核啟動轉錄,并促進炎癥因子高表達,參與調控炎癥反應[2]。

香葉木素(3’,5,7-三羥基-4’-甲氧基黃酮)是一種從柑橘葉或橄欖葉中提取并抑制人CYP1A酶活力的天然黃酮類化合物,具有抑制腫瘤增殖、抗氧化應激的作用[3]。我國學者構建肥厚性心肌病小鼠模型,利用不同濃度香葉木素喂養(yǎng)小鼠,實驗發(fā)現(xiàn)香葉木素通過激活P62/keap1/Nrf2信號通路改善小鼠壓力超負荷致使的心臟肥大[3]。然而,香葉木素對腎I/R誘導急性腎損傷的作用和機制尚未完全闡明。在本研究中,筆者旨在探索香葉木素是否可以改善腎I/R對小鼠腎損傷的程度,并從動物水平探索香葉木素的保護作用以及其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物45只(7～9周齡,20～25 g)雄性BALB/c大鼠購自北京維通利華責任有限公司,動物飼養(yǎng)于恒溫、恒濕SPF級動物房。本研究得到武漢大學人民醫(yī)院動物倫理委員會批準,動物處置方法均符合動物倫理學規(guī)范。

1.2 分組及處理將小鼠隨機分為假手術組(Sham組,n=15)、腎I/R組(I/R組,n=15),香葉木素治療組(Dio組,n=15)。使用滅菌生理鹽水稀釋香葉木素,香葉木素治療組小鼠造模14 d前開始給藥(1 mg/kg),連續(xù)給藥14 d,Sham組和I/R組使用滅菌的生理鹽水作對照處理。14 d治療后,對腎I/R組和香葉木素治療組小鼠進行腎 I/R模型造模。

1.3 I/R模型的建立術前1 d小鼠禁食,不禁水。用體積分數(shù)為5%的戊巴比妥注射液采用腹腔內注射麻醉小鼠,待小鼠無法自我爬行時,分別剪去雙側背部毛發(fā),縱向切開皮膚,分離筋膜、肌肉,暴露雙側腎蒂。雙側腎臟用無損傷顯微動脈夾夾閉,30 min后恢復血供,逐層縫合切口,分別于術后48 h取材。從下腔靜脈取血,利用心室生理鹽水灌流至腎臟,待腎臟變白后腎臟取材。小心游離腎蒂,腎臟置于冰上,快速去除包膜,一半行多聚甲醛固定用于組織形態(tài)學染色,另一半速凍至液氮,轉移至深低溫冰箱,用于蛋白及分子生物學檢測。

1.4 腎功能檢測取小鼠眼球血,使用尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(creatinine,Cr)檢測試劑盒(上海,速徠生物科技有限公司)按照廠家說明書,檢測小鼠體內BUN和Cr水平變化。

1.5 HE染色將小鼠腎組織切片放入二甲苯脫蠟,再依次經梯度酒精復水,將其放入蘇木精中染色2 min,立即用流水沖洗30 min去除浮色并藍化,復染完成后,將切片依次放入梯度酒精中脫水,最后用二甲苯透明,中性樹膠封片,晾干后在顯微鏡(400倍)觀察并拍照。每只小鼠標本獲取5～8個視野,根據(jù)每個視野腎小管上皮細胞擴張程度,紅細胞、炎癥細胞浸潤范圍進行腎小管損傷程度評分(0～4分)。1分:損傷視野<25%;2分:損傷視野<50%;3分:損傷視野<75%;4分:損傷視野>75%。邀請2位病理專業(yè)研究人員,每組小鼠隨機抽取5個視野統(tǒng)計分析。

1.6 免疫組化染色將小鼠腎組織切片浸潤二甲苯脫蠟,依次經梯度酒精復水,將pH=6.0的檸檬酸緩沖液在水浴鍋中加熱至95 ℃～100 ℃,然后把切片放入燒杯中,繼續(xù)加熱煮沸20～25 min后取出室溫自然冷卻;使用免疫組化試劑盒(福州,邁新生物技術開發(fā)有限公司)根據(jù)廠家說明書進行免疫組化檢測。

1.7 免疫印跡技術采用RIPA試劑盒(武漢,塞維爾生物科技),根據(jù)說明書提取小鼠腎組織蛋白,采用BCA試劑盒(美國,Thermo Fisher公司)檢測樣本的蛋白濃度后,水煮變性,置于8%～12%的SDS-PAGE凝膠(武漢,塞維爾生物科技)孔中電泳后,轉印至PVDF膜(美國,Merck Millipore公司),50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,加入特異性一抗4 ℃孵育過夜?；瘜W發(fā)光底物封閉液(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液封閉,放置ECL顯影系統(tǒng)中掃描聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)并成像。使用Image J軟件進行灰度值分析。本研究使用抗體為p-P65抗體(美國,CST公司)。

1.8 實時定量免疫熒光技術(real time qPCR,RT-qPCR)獲取小鼠腎組織,采用核酸檢測儀檢測每組樣品RNA濃度,進行PCR反轉錄合成cDNA,以cDNA為PCR模板,使用ABI熒光定量PCR儀檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR,檢測IL-1、IL-6和TNF-α在小鼠腎組織轉錄水平表達變化(表1)。

表1 炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和內參GAPDH引物序列

2 結 果

2.1 香葉木素對小鼠血清學指標的影響與Sham組小鼠相比,I/R組小鼠血清BUN(圖1A)和Scr(圖1B)的濃度顯著增加,然而給以香葉木素處理后,BUN和Cr指標下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A:尿素氮;B:血肌酐。***與假手術(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001。圖1 假手術組、缺血再灌注組和香葉木素組小鼠血清中BUN和Scr含量的比較

2.2 香葉木素對小鼠腎組織結構的影響為評估香葉木素對小鼠腎組織結構的保護作用,我們對不同組小鼠腎組織切片進行HE染色,結果顯示I/R組與Sham組小鼠腎組織相比,損傷嚴重,光鏡下腎小管廣泛擴張,小管間出現(xiàn)大量紅細胞,以及炎性細胞浸潤,而給予香葉木素處理后,能顯著減少小鼠腎組織損傷程度(圖2A);腎損傷評分差異具有統(tǒng)計學意義(圖2B)。

A:HE染色(×200),黑色箭頭示正常腎小管,紅色箭頭示損傷腎小管;B:三組小鼠腎小管損傷評分,***與假手術(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001;N.D:沒有數(shù)據(jù)。圖2 三組小鼠腎臟HE染色圖及腎小管損傷評分

2.3 香葉木素對小鼠腎組織p-P65蛋白表達的影響P65是NF-κB家族關鍵分子,P65是否磷酸化是NF-κB信號通路激活的關鍵。我們利用免疫組化技術檢測p-P65表達變化情況,結果如圖3A所示,I/R組與假手術組比較,p-P65表達量顯著增加,且部分小鼠腎小管細胞核表達陽性(圖3A黑色箭頭所示),香葉木素處理后,p-P65表達量有所降低。免疫印跡實驗結果同樣發(fā)現(xiàn),I/R組p-P65表達水平與假手術組比較顯著增加,而處理組p-P65表達量降低,灰度值分析具有統(tǒng)計學意義(圖3B、C)。上述結果說明香葉木素可能通過抑制NF-κB信號通路激活緩解小鼠I/R誘導的急性腎損傷。

A:免疫組化(×400),黑色箭頭示p-P65陽性腎小管細胞核;B:Western blot法;C:三組p-P65的表達柱狀圖,***與假手術(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001。圖3 三組小鼠腎組織p-P65蛋白表達

2.4 香葉木素對小鼠腎組織NF-κB下游炎癥因子的影響NF-κB下游炎癥因子是調控機體炎癥的關鍵因素,我們采用實時定量免疫熒光技術檢測NF-κB下游炎癥因子IL-1、IL-6以及腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)在假手術組、I/R組和給藥組的表達水平變化情況(圖4)。I/R損傷組小鼠與假手術組小鼠相比,IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平顯著上調,但是在腎I/R損傷中香葉木素能夠下調NF-κB相關炎癥因子的表達。

***與假手術(Sham)組比較,P<0.001;###與模型(I/R)組比較,P<0.001。圖4 實時定量免疫熒光技術檢測各組小鼠炎癥因子表達水平柱狀圖

3 討 論

I/R時,腎小管堵塞并擴張,炎癥細胞浸潤介導腎小管細胞損傷,致使腎小球濾過率降低、腎單位壞死、腎功能急劇惡化[1,4]。目前由于臨床缺少理想的治療手段緩解腎I/R引起的相關并發(fā)癥,住院患者死亡率較高,重癥患者死亡率可高達50%[5]。因此,尋找新的治療手段是解決當前困境的關鍵。

目前,有大量文獻報道香葉木素在骨肉瘤、動脈粥樣硬化和肥胖等多種疾病中產生保護作用[6-8]。然而目前香葉木素是否能夠保護小鼠腎I/R誘導的急性腎損傷以及其潛在的機制還未見報道。本研究實驗結果顯示香葉木素處理組小鼠血肌酐及尿素氮較I/R模型組小鼠顯著降低,通過HE染色結果發(fā)現(xiàn),I/R模型組小鼠腎小管擴張、缺血,腎小管上皮細胞損傷以及大量炎性細胞浸潤,提示腎臟I/R導致腎組織損傷,其中以腎小管損傷為主,然而給藥組小鼠腎小管擴張、缺血有所緩解,腎小管上皮細胞損傷減輕,且腎小管損傷評分具有統(tǒng)計學意義。NF-κB家族P65是調控炎癥表達的關鍵轉錄因子,其參與調控炎癥級聯(lián)放大反應,介導炎癥細胞聚集并誘導炎癥細胞釋放炎癥因子,在機體中發(fā)揮重要作用。為探索香葉木素的保護作用機制,我們檢測NF-κB信號通路關鍵分子P65磷酸化水平。結果發(fā)現(xiàn),與假手術組小鼠相比,I/R組小鼠p-P65蛋白表達量顯著增加,然而香葉木素能夠降低p-P65蛋白表達水平,表明香葉木素可能通過抑制NF-κB信號通路磷酸化,對I/R誘導的急性腎損傷小鼠產生保護作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn)香葉木素可減少NF-κB信號通路下游炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平,說明香葉木素能夠抑制小鼠體內炎癥反應,緩解I/R誘導的急性腎損傷。然而,本研究缺乏相關試驗進一步證明香葉木素與NF-κB信號通路的關系。

綜合本研究結果,本文證明香葉木素可能通過抑制NF-κB信號通路磷酸化以及該信號通路下游炎癥因子的表達,從而緩解小鼠I/R誘導的急性腎損傷,預示香葉木素可能成為一種新的治療急性腎損傷的藥物。