張佳 ,李欽

河南大學 藥學院,河南 開封475004

0 前言

近些年通過科學家們對陸源微生物的研究表明,從陸源微生物獲得新化合物的幾率比之從前已經大大降低[1]。而海洋微生物物種豐富,生物量約為地球生物總量的87%,有著巨大的開發(fā)潛力[2]。由于海洋微生物次生代謝產物的產生通常與周圍特定的環(huán)境有關,而海洋環(huán)境具有高鹽,高壓,寡營養(yǎng)等特點,為適應這樣的環(huán)境,海洋微生物進化出獨特的生存方式和代謝途徑,從而能夠產生與陸地微生物完全不同的次級代謝產物[3],因此海洋微生物已經成為天然活性物質的研究熱點[4]。根據(jù)對海洋來源的天然產物的調查,科學家們從海洋真菌中分離得到了大量的結構新穎且具有良好生物活性的天然產物,它們結構類型豐富,其中包括萜類,生物堿類,甾體,聚酮等[5],具有細胞毒性,抗炎,抗病毒,抗菌或抗真菌等良好的生物活性[6]。其中從青霉真菌中分離到的天然產物占所有海洋真菌來源的22%[7],青霉菌已經成為一種具有新穎結構和生物活性的有前途的天然產物庫[8]。

本實驗對真菌Penicilliumsp.Z13 的大米培養(yǎng)基的發(fā)酵產物進行了研究,通過1H-NMR 和13CNMR 譜圖數(shù)據(jù)與文獻中已報道的化合物波譜信息進行對比,最終確定了分離得到的10個化合物的結構?；衔?-10結構見圖1。

圖1 從海洋真菌Penicillium sp.Z13中分離到的化合物1-10的結構

1 儀器與材料

儀器:Rotavapor R-210旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司),LC-20A 制備型高效液相色譜儀(日本島津企業(yè)管理有限公司),AVANCE III HD 核磁共振波譜儀(瑞士Brock光譜儀器有限公司),FYLYS-280L恒溫箱(北京福意電器有限公司),GV-2L超聲波清洗儀(深圳市夠威科擠有限公司),MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋(松下健康醫(yī)療器械有限公司),ZHJH-C1112B 超凈工作臺(上海智城分析儀器有限公司),MINI-10K+微型離心機(杭州米歐儀器有限公司),ME 104E 分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

材料與試劑:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(取37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉,加入1 000 mL 蒸餾水溶解,高壓蒸汽滅菌30 min。),大米發(fā)酵培養(yǎng)基(取80 g大米于500 mL錐形瓶中,加入100 mL人工配制海水,p H 7.4～7.8,浸泡2 h,高壓蒸汽滅菌30 min。人工配制海水:33 g海鹽配比1 000 mL超純水),乙酸乙酯(濟南源茂化工有限公司),石油醚(天津市福晨化學試劑有限公司),分析甲醇(天津市富宇精細化工有限公司),分析二氯甲烷(天津市德恩化學試劑有限公司),甲酸(北京紅星化工廠),色譜乙腈(天津康科德科技有限公司),色譜甲醇(天津市四友精細化學品有限公司),娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司),香草醛濃硫酸顯色試劑(5.0 g香草醛,80 mL 濃硫酸,200 mL 超純水,100 mL Et OH)。

菌株:本實驗的供試菌株Penicilliumsp.Z13是從西太平洋雅浦海溝(Yap Trench)深層海水(-4 500 m)中分離得到的,用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)該菌株1 個星期,通過測試ITS 序列,并與genbank 數(shù)據(jù)庫進行對比,鑒定了該菌株屬于Penicillium屬,不能確定其種,因此將此菌株命名為Penicilliumsp.Z13。在超凈工作臺上,將菌種接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上,生長5天后在超凈工作臺上將長有菌絲的培養(yǎng)基塊接種于滅菌了的大米固體培養(yǎng)基中。用大米固體培養(yǎng)基對該菌株進行放大發(fā)酵,大米固體培養(yǎng)基用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min,于30 ℃下靜置發(fā)酵30 d,共發(fā)酵40瓶。

2 提取與分離

用玻璃棒將錐形瓶中發(fā)酵好的的大米搗碎,向其中加入乙酸乙酯200 mL。浸泡充分后,將其轉移至2 000m L錐形瓶中。用保鮮膜封口,超聲清洗30 min。用乙酸乙酯提取三次,合并提取液。將提取液用旋蒸儀濃縮,共獲得20 g 浸膏。將浸膏溶于100 mL 90%甲醇中,加入100 mL 石油醚萃取,共萃取3次,收集下層部分濃縮,共得浸膏8 g。將浸膏過MCI柱,采用甲醇∶水(30∶70→100∶0)梯度洗脫,每個濃度沖300 mL。利用薄層層析硅膠板的檢測結果將樣品進行合并并濃縮,將樣品粗分為7段,P1～P7。其中,P2,P4經過結構鑒定分別確認為4和5,其中P5用ODS柱進行甲醇∶水梯度洗脫(40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%),每個濃度沖300 mL,利用薄層層析硅膠板合并樣品并濃縮得到九個組分,P5-1-P5-9。將P5-8用ODS 柱進行乙腈∶水梯度洗脫(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%),每個濃度沖300 mL,得 到八個組份P5-8-1-P5-8-8。其中組分P5-8-1經HPLC(ODS柱:4.6 mm×150 mm,5μm;紫外燈波長210 nm,254 nm;乙腈∶水=15∶85,3 ml/min)分離純化得到化合物10(2.0 mg,tR=15.8 min)。組分P5-8-8經HPLC(ODS柱:4.6 mm×150 mm,5μm;紫外燈波長:210nm,254nm;乙腈∶水=37∶63,3m L/min)分離純化得到化合物2(34.3 mg,tR=28.5 min)和化合物3(10.5 mg,tR=15.2 min)。將P5-9用ODS 柱進行乙腈:水梯度洗脫(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%),每 個 濃度沖300 mL,得到六個組份P5-9-1-P5-9-6。組分P5-9-1經HPLC(乙腈∶水=47∶53,3 mL/min)分離純化得到化合物8(1.7 mg,tR=8.5 min),9(3.7 mg,tR=10.5 min)和6(3.6 mg,tR=42.4 min)。組分P5-9-5經HPLC(乙腈∶水=40∶60,3 mL/min)分離純化得到化合物1(2.0 mg,tR=32.0 min)。組分P5-9-6經HPLC(乙腈∶水=47∶53,3 mL/min)分離純化得到化合物7(2.0mg,tR=11.8 min)。

3 波譜數(shù)據(jù)

化合物1:無色固體,1H-NMR 中顯示有1個甲基信號δH0.89(d,3 H,J=7.0 Hz,2-Me),δH(1.31～2.38)處有CH 和CH2的多重信號,δH5.93(d,1H,J=9.5 Hz,H-4),5.75(m,1 H,H-3)和5.49(brs,1 H,H-5)均為環(huán)內烯烴質子信號,δH3.79為醇羥基質子信號。13C-NMR 中顯示出18 個碳信號,其中δC135.0(C-4a),133.4(C-3),129.9(C-4)和124.7(C-5)為4 個sp2雜化碳信號,δC78.4(C-11),65.1(C-8)和63.3(C-13)為3個連氧碳信號,δC14.3(2-Me)為1 個甲基碳信號,δC(21.4-39.8)為10個亞甲基碳信號。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR(400 MHz,CD3OD):δH5.93(d,1H,J=9.5 Hz,H-4),5.71(m,1 H,H-3),5.49(brs,1H,H-5),4.71(m,1H,H-11),4.22(m,1H,H-8),3.68(s,1 H,H-13),2.73(m,1H,H-14),2.54(m,1 H,H-14),2.38(m,2H,H-6,H-2),2.19(m,2H,H-6,H-8),1.96(m,2 H,H-7,H-12),1.82-1.69(m,5 H,H-1,H-7,H-9,H-10,H-12),1.55-1.41(m,2H,H-9,H-10),0.89(d,3 H,J=7.0 Hz,2-Me);13C-NMR (100 MHz,CD3OD):δC173.8(C-15),135.0(C-4a),133.4(C-3),129.9(C-4),124.7(C-5),78.4(C-11),65.1(C-8),63.3(C-13),39.8(C-8a),39.1(C-14),37.8(C-1),36.6(C-7),34.0(C-9),32.2(C-2),30.6(C-12),25.0(C-10),21.6(C-6),14.3(2-Me)以上數(shù)據(jù)與文獻報道[9]基本一致,因此鑒定化合物1 為6-desmethylmonacolin-J-15。

化合物2:無色固體,1H-NMR 中δH5.48(1 H,s,H-5),5.71(1 H,dd,J=6.2,3.6 Hz,H-3)和5.92(1H,d,J=9.8 Hz,H-4)為環(huán)內烯烴質子信號,δH4.18-4.23(2H,m)和3.8(1H,m),為醇羥基質子信號,δH0.89(3 H,d,J=7.1 Hz,2-CH3)為甲基質子信號。13C-NMR 中顯示18個碳信號,δC170.0(C-15)為羰基碳信號,δC135.0(C-4a),133.7(C-3),129.8(C-4)和124.5(C-5)為4個sp2雜化碳信號,δC71.3(C-11),68.5(C-13)和65.2(C-8)為3個連氧碳信號,δC14.3(2-Me)為甲基碳信號,δC(21.6～44.8)為9個亞甲基碳和次甲基碳信號。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR(CD3OD,400MHz):δH5.92(1H,d,J=9.8 Hz,H-4),5.71(1 H,dd,J=6.2,3.6 Hz,H-3),5.48(1 H,s,H-5),4.18(1H,m,H-13),4.22(1H,m,H-8),3.8(1 H,m,H-11),2.49(1H,d,J=9.8 Hz,H-14),2.39(3H,m,H-6,H-2),2.18(1H,m,H-8a),2.07(1H,m,H-6),1.94(1H,m,H-7),1.81(2 H,m,H-1,H-9),1.66(1 H,m,H-7,H-12),1.55(1 H,m,H-10),1.41(1 H,m,H-10),1.34(1 H,m,H-9),0.89(3 H,d,J=7.1 Hz,2-CH3)。13C-NMR (100M Hz,CD3OD):δC170.0(C-15),135.0(C-4a),133.7(C-3),129.8(C-4),124.5(C-5),71.3(C-11),68.5(C-13),65.2(C-8),44.8(C-12),43.7(C-14),40.0(C-8a),37.8(C-1),35.5(C-10),32.2(C-2),30.6(C-7),25.0(C-9),21.6(C-6),14.3(2-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[10]基本一致,因此鑒定化合物2為 3,5-dihydroxy-7-(8-hydroxy-2-met-hy-hexahydronap H-thalen-1-yl)heptanoicacid。

化合物3:淡黃色粉末,在1H-NMR 的芳香區(qū)顯示有4套苯環(huán)系統(tǒng),δH3.06(s,3H,H-27)和2.90(s,3 H,H-10)均為甲基峰信號。在13C-NMR 中,δC172.2(C-1),171.1(C-18),170.7(C-28)和168.2(C-11)為4 個酰胺碳信號,δC(138.1～121.7)均為sp2雜化碳信號,δC39.8(C-10)和29.6(C-27)為N-CH3信號,δC35.2(C-3)和32.9(C-20)為亞甲基碳信號,氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR(400 MHz,CD3OD):δH7.96(d,1H,J=7.8 Hz,H-13),7.82(d,1H,J=7.8 Hz,H-30),7.59(t,1H,J=7.8 Hz,H-15),7.50(t,1H,J=7.8 Hz,H-32),7.33(t,1H,J=7.3 Hz,H-14),7.28-7.18(m,10 H,H-6～8,16,22～26,31),7.07(d,1H,J=8.5 Hz,H-33),7.02(d,1H,J=7.0 Hz,H-5),4.42(t,1 H,J=7.3 Hz,H-19),4.33(dd,1H,J=7.0,4.0 Hz,H-2),3.39(m,1 H,H-20),3.24(dd,1 H,J=7.4,7.3 Hz,H-20),3.06(s,3H,H-27),2.90(s,3H,H-10),2.78(dd,1H,J=7.0,7.4 Hz,H-3),2.66(m,1 H,H-3);13C-NMR (100 MHz,CD3OD):δC172.2(C-1),171.1(C-18),170.7(C-28),168.2(C-11),138.1(C-21),137.9(C-34),137.1(C-4),137.0(C-17),134.2(C-15),133.75(C-32),132.3(C-13),131.8(C-30),130.0(C-5),130.0(C-9),130.0(C-22),130.0(C-26),129.8(C-6),129.6(C-8),129.6(C-23),129.6(C-25),128.3(C-7),128.3(C-29),127.8(C-24),127.7 (C-12),125.9(C-31),125.9(C-14),122.0(C-33),121.7(C-16),69.7(C-2),57.9(C-19),39.8(C-10),35.2(C-3),32.9(C-20),29.6(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[11]基本一致,因此鑒定化合物3為penicopeptide A。

化合物4:白色晶體,1H-NMR 中芳香區(qū)顯示含有兩套苯環(huán)系統(tǒng),δH3.10(s,3 H,H-19)為NCH3信 號,在13C-NMR 中,δC168.7 (C-2),168.4(C-5)為兩個酰胺碳信號,δC158.5(C-15)為酚羥基芳香碳信號,δC71.7(C-3)和66.0(C-10)為連氧碳信號,δC31.7(C-19)為N-CH3信號,其余碳均為sp2雜化碳信號,氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1HNMR(400 MHz,CD3OD):δH7.56(m,1H,H-8),7.15(m,3 H,H-6,7,9),7.01(t,1 H,H-17),6.71(dd,1H,H-16),6.15-6.10(dd,2 H,J=7.8 Hz,H-14,18),4.03(s,1H,H-10),3.10(s,3 H,H-19);13C-NMR (100 M Hz,CD3OD):δC168.7(C-2),168.4(C-5),158.5(C-15),136.5(C-12),134.0(C-13),133.5(C-7),132.2(C-6),130.3(C-17),128.0(C-11),126.1(C-8),122.3(C-9),118.5(C-18),117.1(C-16),113.9 (C-14),71.7(C-3),66.0(C-10),31.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[12]基本一致,因此鑒定化合物4為cyclopenol。

化合物5:白色晶體,對比化合物5和化合物4的氫譜和碳譜數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)化合物5中少了一個連氧的芳香碳信號(δC158.5),但多了1 個芳香碳信號(δC130.1),又因為C14(δC122.4)與C18的化學位移相同,C15(δC130.1)與C17化學位移相同,由此可以推斷化合物5中含有一個單取代苯環(huán),又因其氫譜并未顯示羥基信號,推斷化合物5比化合物4的C15位少一個羥基,氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δH7.57 (m,1H,H-7),7.30(m,1 H,H-16),7.24-7.13(m,4 H,H-6,8,15,17),7.07(m,1H,H-9),6.70(m,2H,H-14,18),4.18(s,1H,H-10),3.35(s,3H,H-19);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6):δC168.6(C-2),168.4(C-5),136.6(C-15),134.1(C-12),132.2(C-13),132.1(C-7),130.1(C-6),130.1(C-17),129.2 (C-11),128.0 (C-8),127.3 (C-9),126.1(C-18),122.4(C-16),122.4(C-14),71.7(C-3),66.0(C-10),31.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[12]基本一致,因此鑒定化合物5為cyclopenin。

化合物6:無色棱狀結晶,1H-NMR 芳香區(qū)顯示有9個芳環(huán)氫信號,其中包括苯環(huán)二取代的4個氫信號δH(7.04～7.32),和苯環(huán)單取代的5個氫信號δH(7.36～7.53),低場區(qū)顯示活潑氫信號δH12.23(s,1 H,NH),δH9.23(s,1 H,OH-3)。13C-NMR 顯示有15 個碳信號,包括1 個內酰胺羰基碳信號δC158.45,14個sp2雜化碳信號δC(133.9～115.28)。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR (400 MHz,CD3OD):δH12.23(s,1 H,NH),9.23 (s,1 H,OH-3),7.53～7.34(m,5H,H-1′～H-5′),7.32～7.29(m,2 H,H-8,H-7),7.09～7.04(m,2 H,H-6,H-5);13C-NMR (100 MHz,CD3OD):δC158.5(C-2),142.8(C-8a),133.9(C-1′),133.1(C-3),128.4(C-3′),128.4(C-5′),127.6(C-4′),126.3(C-7),124.3(C-5),123.8(C-4),122.1(C-6),122.1(C-6′),121.0(C-4a),115.3(C-8),12.9(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[13]中的基本一致,因此鑒定化合物6為viridicatol。

化合物7:無色結晶,1H-NMR 數(shù)據(jù)顯示有2套芳環(huán)系統(tǒng),在低場區(qū)δH12.20(s,1 H,NH)處顯示有含氮的活潑氫信號,δH9.52(s,1H,OH-3′)和9.15(s,1H,OH-3)表示有酚羥基的活潑氫信號,13CNMR 數(shù)據(jù)顯示化合物7中有15個碳,其中δC158.3(C-2)為酰胺羰基碳信號,δC157.3(C-3′)為酚羥基碳信號,其余13根碳δC(114.6～142.2)均為sp2雜化碳信號,推測化合物7含有喹啉環(huán)結構,氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR (400 MHz,DMSOd6):δH12.20(s,1 H,NH),9.52(s,1H,OH-3′),9.15(s,1H,OH-3),7.33～7.27(m,3H,H-8,H-5,H-5′),7.09～7.06(m,2H,H-7,H-6),6.82(m,1 H,H-4′),6.71(m,2 H,H-6′,H-2′);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6):δC158.3(C-2),157.3(C-3′),142.2(C-8a),134.9(C-1′),133.1(C-4),129.4(C-5′),126.4(C-5),124.5(C-7),124.1(C-3),122.1(C-6),120.9(C-4a),120.4(C-6′),116.7(C-2′),115.2(C-8),114.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[14]中的基本一致,因此鑒定化合物7為viridicatin。

化合物8:白色無定型粉末,根據(jù)1H-NMR 中芳香區(qū)的信號可知化合物8中含有二取代苯環(huán),在13C-NMR 中,δC(112.8～138.2)均為sp2雜化碳信號。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1H-NMR(CD3OD,400 MHz):δ8.07(1H,m,H-4),7.93(1H,s,H-3),7.43(1H,m,H-7),7.20(1H,m,H-6),7.17(1H,m,H-5);13C-NMR(CD3OD,100 MHz):δ 138.2(C-8),133.2(C-3),127.7(C-6),123.5(C-9),122.3(C-4),122.1(C-5),112.8(C-7)。波譜數(shù)據(jù)與文獻報道[15]一致,因此確定為吲唑。

化合物9:黃色粉末,根據(jù)1H-NMR δH(7.04～7.59)的信號可知化合物9中含有鄰二取代的苯環(huán)。在13C-NMR 譜中,δC176.8(C-11)為羧基碳信號,δC(109.11～138.02)為sp2雜化碳信號,δC32.2(C-10)為亞甲基碳信號。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1HNMR(CD3OD,400 MHz):δH7.54(1H,d,J=8.13 Hz,H-4),7.16(1 H,s,H-2),7.33(1 H,d,J=8.01 Hz,H-7),7.09(1H,t,H-6),7.01(1H,t,H-5),3.72 (2H,s,H-10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz):δC176.8(C-11),138.0(C-9),128.7(C-8),124.6(C-2),122.4(C-5),119.8(C-4),119.5(C-6),112.2(C-7),109.1(C-3),32.2(C-10)。波譜數(shù)據(jù)與文獻報道[16]一致,因此確定為吲哚乙酸。

化合物10:白色粉末,1H-NMR 譜δH4.30(1H,m,H-9)和δH4.14(1H,m,H-6)處有CH 的多重峰信號,高場區(qū)δH(0.9～2.45)可見系列的CH2和CH 多重峰信號,氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下:1HNMR(CD3OD,400 MHz):δH4.30(1 H,m,H-9),4.14(1H,m,H-6),3.74(2H,m,H-3),3.61(2 H,m,H-4),2.44(1 H,m,H-10),1.69(1H,m,H-11),1.50(1H,m,H-11),1.15(3H,m,H-13),0.92(3H,m,H-12)。波普數(shù)據(jù)與文獻報道[17]基本一致,因此確定為環(huán)(異亮氨酸-脯氨酸)。

4 總結

本文對深海真菌Penicilliumsp.Z13的次級代謝產物進行了研究,對其大米發(fā)酵物的乙酸乙酯浸膏進行分離得到了10個化合物,其中有8個為生物堿,2個為莫納可林類化合物。1,2,8,9和10均為首次從深海真菌Penicillium中得到。查閱文獻得知,化合物3,4,5,7均有不盡相同的活性。其中化合物3有良好的生理活性,它在體外對11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)表現(xiàn)出顯著的抑制活性,并與11β-HSD1 表現(xiàn)出較強的結合親和力[11]?；衔?對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和黃體微球菌表現(xiàn)出了中等抗菌活性[18]?；衔?之前報道它有強大的細胞毒性[19],但在研究中發(fā)現(xiàn),當濃度為10m M 時,它對HL60和A549細胞系沒有活性[20]。另外在文獻[21]報道中化合物4具有抑制酶活性和脾淋巴細胞增殖的作用,值得繼續(xù)研究它的其他生物活性的,如抗菌和抗病毒活性。除此之外,化合物4和5還被報道為具有植物生長調節(jié)劑和抗菌特性[18]。上述情況說明該菌株的次級代謝產物具有豐富的生物活性,青霉菌屬的研究價值進一步被有力的證明,這為海洋資源的開發(fā)和有良好活性的先導化合物的發(fā)現(xiàn)及研究奠定了一定的基礎。