吳阮琦 謝艷 張亞琴 陳興福 吳秀清 高宇明

【摘 要】 目的：旨在分析四川省不同地區(qū)丹參藥材的質量一致性，進而探索四川省丹參產業(yè)布局。方法：采用法定方法對四川省巴中、德陽和資陽地區(qū)丹參樣品的水分、浸出物、丹參酮類和丹酚酸B含量以及指紋圖譜進行測定，運用分析軟件對測定結果分別進行單因素方差分析、聚類分析和中藥色譜指紋圖譜相似度評價。結果：方差分析結果表明3個地區(qū)丹參樣品不存在顯著性差異，聚類分析結果顯示22批次丹參樣品不存在明顯的產地區(qū)別，指紋圖譜相似度評價結果得出3個地區(qū)丹參相似度高。結論：巴中、德陽和資陽地區(qū)的丹參質量一致性高且品質優(yōu)良。

【關鍵詞】 川產丹參；質量一致性；單因素方差分析；聚類分析；指紋圖譜相似度評價

【中圖分類號】R284.1? ?【文獻標志碼】 A? ? 【文章編號】1007-8517（2023）08-0027-07

Abstract：Objective? In order to study the quality consistency of Salvia miltiorrhiza from different districts and research the industrial layout of Salvia miltiorrhiza in Sichuan province， 22 batches of Salvia miltiorrhiza samples were collected from three districts （Bazhong， Deyang and Ziyang） in Sichuan province. Methods? The contents of water， extract， tanshinone， salvianolic acid B and fingerprint were determined by legal methods respectively. Then the one-way ANOVA， the cluster analysis and the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional chinese medicine （TCM） were used for statistical analysis.Results The results of one-way ANOVA show that 22 batches of Salvia miltiorrhiza samples from different districts are simliar. The result of cluster analysis show that the quality of Salvia miltiorrhiza samples from three districts has no essential differences. And the result of the similarity evaluation for chromatographic fingerprint of TCM indicates the quality of Salvia miltiorrhiza samples from Bazhong， Deyang and Ziyang districts have almost the same.Conclusion The Salvia miltiorrhiza samples from three districts in Sichuan province have high quality consistency， while Bazhong， Deyang and Ziyang are considered to be the suitable districts for Salvia miltiorrhiza cultivation.

Key words：Salvia miltiorrhiza from Sichuan Province; Quality Consistency; One-way ANOVA; Cluster Analysis; Fingerprint Similarity Evaluation

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖［1］，藥用歷史悠久［2］，具有活血祛瘀、通經止痛等功效。四川省德陽市中江縣是丹參公認的道地產區(qū)［3-4］。隨著中江丹參種植帶來的可觀的經濟效應，四川省多個地區(qū)亦紛紛開始引種栽培丹參，但對于四川省內不同地區(qū)栽培的丹參品種的質量分析卻未見國內（外）文獻報道。

本研究收集了四川省巴中市、德陽市和資陽市共22批次丹參樣品，對水分、浸出物、丹參酮類和丹酚酸B含量以及液相指紋圖譜測定結果分別進行單因素方差分析、聚類分析和指紋圖譜相似度評價，以期從不同角度評價川內不同地區(qū)丹參的品質，為探索四川省丹參產業(yè)布局提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT液相色譜儀（配SPD-20A檢測器）；MS205DU電子天平（梅特勒托利多）；HY-8型搖床（蘇州威爾實驗用品公司）；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司）；TGL-16M型離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）；KQ-700DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；SPSS軟件24.0版（IBM公司）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.130723版本（國家藥典委員會）。

1.2 試劑 丹參酮IIA對照品（中國食品藥品檢定研究院110766-201721）純度為99.5%，丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院111562-201716）純度為96.6%，甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司），水為注射用水，其他為分析純。

1.3 藥材 共收集到川內不同地區(qū)的栽培丹參樣品22批次，采集時間為2018年12月。經資陽市食品藥品檢驗檢測中心吳秀清主任中藥師鑒定為丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）。詳見表1。

2 方法

2.1 水分和浸出物 分別參照《中國藥典》（2015年版）四部的通則0832項下第二法測定各樣品的水分，結果不得過13%；通則2201項下冷浸法測定各樣品的水溶性浸出物，結果不得少于35.0%；通則2201項下熱浸法測定各樣品的醇溶性浸出物，用乙醇作溶劑，結果不得少于15.0%。

2.2 丹參酮類含量測定 參照《中國藥典》（2015年版）一部中丹參品種項下的方法，所得丹參酮類含量以干燥品中丹參酮IIA、隱丹參酮和丹參酮I的總量計，結果不得少于0.25%。

2.2.1 對照品溶液制備 取丹參酮IIA對照品11.56 mg置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得到濃度為1.15 mg/mL的對照品儲備液；再精密量取儲備液1.00 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度為23.00 μg/mL的丹參酮IIA對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取D1號丹參樣品粉末 （過三號篩）約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 選用XselectR Hss T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.02%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫（0～6 min，61%乙腈；6～20 min，61%～90%乙腈；20～20.5 min，90%～61%乙腈；20.5～25 min，61%乙腈），柱溫為20 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，進樣量10 μL。以丹參酮IIA對照品為參照，以其相應的峰為S峰，計算隱丹參酮和丹參酮I的相對保留時間，其相對保留時間應在規(guī)定值的±5%以內，相對保留時間及校正因子見下表2。丹參酮IIA含量測定圖譜如圖1所示。

2.2.4 線性關系 精密量取濃度為1.15 mg/mL的丹參酮IIA對照品儲備液0.25 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.00 mL分別置于100 mL、50 mL、50 mL、50 mL、25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度為2.875 μg/mL、5.75μg/mL、11.50μg/mL、23.00μg/mL、46.00μg/mL的系列標準溶液，采用2.2.3項下液相色譜條件測定，以峰面積與對照品濃度進行線性回歸，得相關系數r=0.9998，表明該方法有良好的線性關系。

2.2.5 精密度 精密吸取丹參酮IIA對照品溶液，采用2.2.3項下液相色譜條件重復進樣 6 次，測定峰面積，計算丹參酮IIA峰面積的RSD為0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性 取D1號丹參樣品，按 2.2.2項下方法制備6 份供試品溶液，采用2.2.3項下液相色譜條件，分別進樣測定，計算丹參酮類總含量，分別為：0.27%、0.26%、0.29%、0.28%、0.27%、0.26%，RSD為4.30%，表明該方法的重復性良好。

2.2.7 加標回收 精密稱取 D1號丹參樣品6 份，每份約0.3 g，分別精密加入濃度為1.15 mg/mL的丹參酮IIA對照品儲備液0.20 mL，再精密加入甲醇49.8 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液（濃度約為9 μg/mL），按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，采用2.2.3項下液相色譜條件，分別進樣測定，計算丹參酮IIA含量，結果見表3，平均回收率為98.2%，RSD 為 1.52%，表明該方法準確可靠。

2.2.8 穩(wěn)定性 取D1號丹參樣品按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，采用2.2.3項下液相色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 進樣測定，計算丹參酮IIA的峰面積，得RSD為1.66%，表明樣品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.3 丹酚酸B含量測定 參照《中國藥典》（2015年版）一部中丹參品種項下的規(guī)定，采用高效液相色譜法，所得丹酚酸B含量以干燥品計，結果不得少于3.0%。

2.3.1 對照品溶液制備 取丹酚酸B對照品116.2 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇∶水（8∶2）混合溶液溶解并稀釋至刻度，得到濃度為11.22 mg/mL的對照品儲備液；再精密量取儲備液0.10 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇∶水（8∶2）混合溶液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含 0.1122 mg 的丹酚酸B對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取D1號丹參樣品粉末 （過三號篩）約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇：水（8∶2）混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇∶水（8∶2）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，移至10 mL量瓶中，加甲醇∶水（8∶2）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件 選用 XselectR Hss T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈—0.1%磷酸溶液（22∶78）為流動相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為286 nm，進樣量10 μL。丹酚酸B含量測定圖譜如圖 2所示。

2.3.4 線性關系 精密量取濃度為11.22 mg/mL的丹酚酸B對照品儲備液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、0.20 mL、0.50 mL分別置于100 mL、100 mL、100 mL、10 mL、10mL 容量瓶中，加甲醇—水（8∶2）混合溶液稀釋至刻度，配制成濃度為22.44 μg/mL、56.10 μg/mL、112.2 μg/mL、224.4 μg/mL、561.0 μg/mL的系列標準溶液，采用2.3.3項下液相色譜條件測定，以峰面積與對照品濃度進行線性回歸，得相關系數r=0.9996，表明該方法有良好的線性關系。

2.3.5 精密度 精密吸取丹酚酸B對照品溶液，采用2.3.3項下液相色譜條件重復進樣 6 次，測定峰面積積分值，計算丹酚酸B 峰面積的RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性 取D1號丹參樣品，按 2.3.2項下方法制備6 份供試品溶液，采用2.3.3項下液相色譜條件，分別進樣測定，計算丹酚酸B含量，分別為：8.4%、8.3%、8.6%、8.2%、8.5%、8.2%，RSD為1.95%，表明該方法的重復性良好。

2.3.7 加標回收 精密稱取 D1號丹參樣品6 份，每份約0.15 g，分別精密加入濃度為11.22 mg/mL的丹酚酸B對照品儲備液1.00 mL，再精密加入甲醇∶[KG-*3/5]水（8∶2）混合溶液49.0 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇∶[KG-*3/5]水（8∶2）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，移至10 mL量瓶中，加甲醇∶[KG-*3/5]水（8∶2）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液（濃度約為231 μg/mL），采用2.3.3項下液相色譜條件，分別進樣測定，計算丹酚酸B含量，結果見表4。丹酚酸B平均回收率為98.5%，RSD 為 1.76%，表明該方法準確可靠。

2.3.8 穩(wěn)定性 取D1號丹參樣品按照2.3.2項下方法制備供試品溶液，采用2.3.3項下液相色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 進樣測定，計算丹酚酸B的峰面積， 得RSD為1.86%，表明樣品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜 供試品溶液、對照品溶液制備與色譜條件參考香港中藥材標準中丹參項下高效液相指紋圖譜鑒別方法［5］，選用XselectR Hss T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-（水∶乙腈∶甲酸=90∶1∶0.4）為流動相，梯度洗脫（0～40 min，0%～30%；40～50 min，30%～80%；50～70 min，80%～85%），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進樣量10 μL。

3 結果

3.1 單因素方差分析 22批次丹參樣品水分、浸出物、丹參酮類和丹酚酸B的含量測定結果見表5。從表5可得，22批次樣品中除Z1、Z2和B6的醇溶性浸出物含量略低于2015年版中國藥典的要求（不得少于15.0%）外，其余樣品均符合相應的標準要求。

采用SPSS 24.0軟件對分別巴中、德陽和資陽3個地區(qū)丹參樣品的水分、浸出物、丹參酮類和丹酚酸B含量進行單因素方差分析［6-8］，結果見表6。通過比較平均值可看出，巴中地區(qū)丹參樣品的水溶性浸出物含量高于資陽和德陽；德陽地區(qū)丹參樣品的丹參酮類含量低于巴中和資陽；資陽地區(qū)的水分含量高于巴中和德陽，但醇溶性浸出物含量低于巴中和德陽。方差齊性檢驗結果顯示3個地區(qū)樣品的水分、浸出物、丹參酮類和丹酚酸B的P1值均大于0.05，表明3個地區(qū)樣品方差齊性適合進行單因素方差分析；當顯著性水平為0.05時，進行單因素方差分析計算得到的P2值均大于0.05，即巴中、德陽和資陽3個地區(qū)丹參樣品的水分、浸出物、丹參酮類和丹酚酸B含量均不存在統(tǒng)計學上的顯著性差異。

3.2 聚類分析 對于3個地區(qū)丹參樣品的整體質量差異分析，本研究采用SPSS 24.0軟件對22批次丹參樣品進行系統(tǒng)聚類分析［8-10］。參與系統(tǒng)聚類分析的變量為水分含量、浸出物含量、丹參酮類含量和丹酚酸B含量，聚類方法的樣品間距離的計算采用歐式距離法。聚類結果如圖3所示。當閾值為10時，22批次丹參樣品聚為2類，閾值小表明樣品性相似高。Z2、D5、B3、D7單聚為一類，其余18個樣品聚為一類，是因為這4個樣品的水溶性浸出物含量均低于50%，較其他樣品低。系統(tǒng)聚類的結果不呈現地區(qū)性，每個類別中均有3個產地的樣品存在，表明3個產地的丹參可能具有同源性。

3.3 指紋圖譜相似度評價［10-11］

3.3.1 對照指紋圖譜R的生成 將22張丹參樣品的HPLC譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本），以D1為參照圖譜，采用“中位數”法，設置時間窗寬度為0.1，通過多點校正法對色譜峰進行全譜峰匹配，從而得到對照指紋圖譜R。如圖4所示，共得到15個共有峰。

3.3.2 不同地區(qū)指紋圖譜比較 將生成的對照指紋圖譜R分別與巴中、資陽和德陽地區(qū)丹參樣品的HPLC譜圖進行相似度比較。22個丹參樣品的HPLC譜圖中均匹配到了15個共有峰，相似度評價結果見表7。從表7中可以看出，來自巴中、資陽和德陽的22個丹參樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜R的相似度均在0.997以上，表明巴中、資陽和德陽3個地區(qū)丹參的質量相似度高，不存在明顯差別。

4 討論

隨著中藥在國際市場的廣泛應用，對中藥的質量可控性要求日益增高。然而中藥源植物存在天然變異性，同種植物常常由于環(huán)境的不同可能導致遺傳基因的變化而產生質量差異［12］，因此對不同產地的丹參藥材進行質量一致性分析是十分必要的。

高瑜等［13］和邱曉萍等［14］分別通過物種分布模型和最大熵模型分析得出我國中部、東部的大部份地區(qū)都是丹參的環(huán)境適宜區(qū)，氣候類變量對丹參分布的影響較大，而土壤類和地形類變量的影響較小。

巴中市位于東經 106°21′～107°45′和北緯 31°15′～ 32°45′之間，海拔159～2503 m，年平均氣溫16.2～17.1 ℃，年平均降雨量約為 1200 mm；德陽市中江縣位于東經104°41′～105°15′和北緯30°55′～31°29′之間，海拔306～1046 m，年平均氣溫約16.7 ℃，年平均降水量約882.5 mm；資陽市位于東經104°21′～105°27′和北緯29°15′～30°17′之間，海拔300～550 m，年平均氣溫約17.0 ℃，年平均降水量約1100.0 mm。

巴中、德陽和資陽雖各位于四川盆地東北部、西北部和東部，但均屬于亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫和降水量等氣候變量相似。與本實驗結果巴中、德陽和資陽地區(qū)的丹參質量一致性高相符。

此外，就丹參的品質而言，丹參藥材的主要活性物質是脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸類物質，丹參酮類和丹酚酸類具有心腦血管保護、抗菌、調節(jié)血脂等作用［15］。丹參酮類物質隨緯度降低而升高，與經度和海拔間的相關性不強；在溫暖濕潤、晝夜溫差相對小的地區(qū)，丹參酮類成分的含量較高［16］。本實驗收集的巴中、德陽和資陽樣品中丹參酮類含量平均值分別為0.90%、0.62%和0.96%，是標準規(guī)定值的2～4倍；丹酚酸B含量平均值分別為7.9%、8.3%和7.5%，是標準規(guī)定值的2～3倍；表明巴中、德陽和資陽丹參的品質優(yōu)良，此結果與文獻報道的“就丹參中丹參酮類、酚酸類含量而言，四川產地的丹參綜合來看質量較為上乘［17］”相一致。這亦與巴中、德陽和資陽三地處于相近的經緯度、均具有溫暖濕潤、四季分明的亞熱帶溫潤氣候密不可分。

5 結論

本研究表明，巴中、德陽和資陽地區(qū)所產丹參質量一致性高且品質優(yōu)良，故可認為此3個地區(qū)均適宜丹參栽培。

參考文獻

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：76-77.

［2］趙寶林，錢楓.丹參的本草考證［J］.中藥材，2009，32（6）：991-994.

［3］梁飛.道地藥材考——以20種中藥為例［D］.北京：北京醫(yī)藥大學，2013：86-87.

［4］陳曉玉，賀超，閆濱濱，等.丹參主產區(qū)栽培技術差異性調查分析［J］.中國中藥雜志，2019，44（7）：1314-1320.

［5］香港衛(wèi)生署.香港中藥材標準（第一冊）［S］.香港：香港衛(wèi)生署，2005：82-83．

［6］牛凱.數據分析之單因素方差分析［J］.產業(yè)與科技論壇，2019，18（2）：57-58.

［7］鄒祎.SPSS軟件單因素方差分析的應用［J］.價值工程，2016（34）：219-222.

［8］武松.SPSS實戰(zhàn)與統(tǒng)計思維［M］.北京：清華大學出版社，2019：309-312.

［9］趙姍姍.基于SPSS中系統(tǒng)聚類的CPI分析［D］.新鄉(xiāng)：河南師范大學，2013：27-36.

［10］劉江，陳興福，楊文鈺，等.川麥冬野生種質資源色譜特征圖譜的建立及其系統(tǒng)聚類分析［J］.中國中藥雜志，2010，35（20）：2726-2730.

［11］鄒純才，鄢海燕.我國中藥色譜指紋圖譜相似度評價方法30年（1988～2017年）研究進展與展望［J］.中國中藥雜志，2018，43（10）：1969-1977.

［12］何毅，肖傳學，朱永宏，等.從源頭探討中藥國際化之路［J］.中草藥，2012，43（4）：630-635.

［13］高瑜，李佳穎，劉宇哲，等.基于組合模型的丹參潛在地理分布研究［J］.植物科學學報，2021，39（6）：571-579.

［14］邱曉萍，張懿，張詠梅.全球氣候變化對丹參潛在適宜區(qū)分布影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2022，29（9）：1-10.

［15］王維婷，單成鋼，倪大鵬，等.丹參有效成分代謝生理生化及分子生物學研究進展［J］.中藥材，2009，32（9）：1472-1476.

［16］張辰露，梁宗鎖，郭宏波，等.不同氣候區(qū)丹參生物量、有效成分變化與氣象因子的相關性研究［J］.中國中藥雜志，2015，40（4）：607-613.

［17］王娟，邵遠洋，晉小雁，等.不同產地丹參ITS序列及有效成分差異分析［J］.中國實驗方劑學雜志2017，23（11）：40-44.

（收稿日期：2022-08-05 編輯：陶希睿）