韓亞斐 周泉 隋愛華 尤紅娟 姚如永

摘要：為提高黑曲霉與泡盛曲霉固態(tài)共發(fā)酵麥麩釋放酚類活性物質(zhì)的能力，以培養(yǎng)基總酚含量為評價(jià)發(fā)酵效果的指標(biāo)，應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析法優(yōu)化共發(fā)酵條件，通過光吸收法測定酚類產(chǎn)物的DPPH自由基清除率及總還原能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉與泡盛曲霉固態(tài)共發(fā)酵麥麩的最佳工藝參數(shù)為：麥麩10.0 g、（NH4）2SO4含量17.0 mg/g麥麩、KH2PO4含量1.8 mg/g麥麩、含水量79.05%、黑曲霉與泡盛曲霉接種比例1∶2、接種量為1.1 mL（約1×107個(gè)孢子/mL）、發(fā)酵溫度29 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d。此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量達(dá)到2 498.34 μg/g，比優(yōu)化前提高了37.32%。發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率、總還原力較優(yōu)化前亦顯著提高（P<0.05）。該工藝優(yōu)化既提高麥麩釋放酚類含量，又增強(qiáng)了產(chǎn)物的抗氧化能力，為麥麩的充分利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：固態(tài)共發(fā)酵；黑曲霉；泡盛曲霉；響應(yīng)面法；抗氧化性

中圖分類號：Q815 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-1037（2023）02-0011-09

doi：10.3969/j.issn.1006-1037.2023.02.03

基金項(xiàng)目：

青島市中醫(yī)藥科技重點(diǎn)項(xiàng)目（批準(zhǔn)號：2021-ZYYZ09）資助。

通信作者：

姚如永，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤微環(huán)境、微生物藥學(xué)等。

麥麩作為小麥加工的主要副產(chǎn)品［1］，含多種營養(yǎng)物質(zhì)，但由于其難消化、機(jī)體吸收利用度差，尚未得到充分開發(fā)利用［2］。麥麩中含有豐富的天然酚類化合物，包括游離酚類（對羥基苯甲酸、沒食子酸、香草酸、咖啡酸以及對香豆酸）和結(jié)合酚丁香酸、阿魏酸、肉桂酸和綠原酸等［3］。酚類物質(zhì)不僅具有顯著的抗氧化、抗菌、降血脂、抗突變與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，還能抵抗環(huán)境中存在的烴、亞硝胺及真菌毒素等有害物質(zhì)的誘變作用［4］。但麥麩中天然酚類化合物只有少量的游離酚和部分共軛酚可被小腸接觸和吸收，生物利用度較低，如何提高麥麩中酚類物質(zhì)利用度成為研究熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)強(qiáng)酸強(qiáng)堿化學(xué)提取方法難以保持提取物的生物活性，且環(huán)境污染大。谷物基質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵后，產(chǎn)生的酶能切斷結(jié)合酚的化學(xué)鍵，促進(jìn)酚類物質(zhì)釋放，從而提高其生物利用度及生物活性［5-6］，因此目前研究側(cè)重微生物發(fā)酵。黑曲霉（Aspergillus niger）與泡盛曲霉（Aspergillus awamori）廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵，二者都具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)與分泌能力［7-8］，谷物基質(zhì)經(jīng)其發(fā)酵可顯著提高酚類物質(zhì)含量［9-10］。盡管黑曲霉和泡盛曲霉發(fā)酵均可以釋放麥麩中的結(jié)合型酚酸，但大部分為液態(tài)發(fā)酵法，主要集中于單一菌種發(fā)酵，效率較低［11］。采用復(fù)合菌株協(xié)同發(fā)酵，可充分發(fā)揮微生物間的共生關(guān)系和互補(bǔ)性，提高發(fā)酵物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率［12］。采用納豆芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵麥麩，所測發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)明顯增加，同時(shí)混合發(fā)酵產(chǎn)物的功能和作用均顯著優(yōu)于單發(fā)酵產(chǎn)物［13］，證明復(fù)合菌株發(fā)酵具有明顯優(yōu)勢。固態(tài)發(fā)酵相比液態(tài)發(fā)酵酚酸產(chǎn)量高，分解能力強(qiáng)，所得發(fā)酵組分具有更優(yōu)異的生物活性和功能［14］。目前，微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩釋放酚類物質(zhì)的相關(guān)研究報(bào)道較少［15］，采用黑曲霉和泡盛曲霉固態(tài)共發(fā)酵麥麩釋放酚類的研究尚未見報(bào)道。本文以麥麩為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)，分別探究麥麩添加量、（NH4）2SO4及KH2PO4含量、菌種比例、接種量、培養(yǎng)基含水量及發(fā)酵時(shí)間、溫度等對發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量的影響，以Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化混合發(fā)酵工藝，研究發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性，為資源的再生利用、提高麥麩生產(chǎn)附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和試劑

黑曲霉GSTCC 60108、泡盛曲霉AF93028購自中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心（武漢）。

麥麩為市售（產(chǎn)地山東）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar， PDA）培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基試劑、沒食子酸購自默沙克生物有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene， BHT）由上海中秦化學(xué)試劑有限公司提供；Na2CO3、（NH4）2SO4、KH2PO4、甲醇均由上海埃彼化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸液制備 斜面培養(yǎng)基：稱取46.0 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂，量取1 000.0 mL蒸餾水，121 ℃滅菌30 min。取黑曲霉與泡盛曲霉分別接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)4～6 d。待孢子成熟后，加入5.0 mL無菌生理鹽水（含2%甘油），用無菌涂布棒輕輕平刮菌落表面，制成孢子懸液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)使孢子濃度為1×107個(gè)/mL。

1.2.2 菌株單獨(dú)發(fā)酵 稱取已烘干麥麩5.0 g，放入250 mL錐形瓶中，加入16.0 mg （NH4）2SO4、1.0 mg KH2PO4及4.0 mL水，自然pH，搖晃均勻后密封，121 ℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，分別接種1.0 mL（約1×107個(gè)孢子/mL）黑曲霉、泡盛曲霉孢子懸液，混勻后于30 ℃恒溫恒濕發(fā)酵6 d。

1.2.3 固態(tài)共發(fā)酵 分別按1∶1、1∶2和2∶1的菌種比例接種1.0 mL（約1×107個(gè)孢子/mL）黑曲霉和泡盛曲霉孢子懸液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖勻后30 ℃培養(yǎng)4～6 d，比較分析各比例及相同比例下各發(fā)酵條件的結(jié)果。

1.2.4 發(fā)酵后基質(zhì)處理 分別準(zhǔn)確稱取各發(fā)酵條件的固態(tài)基質(zhì)5.0 g于容器中，加入100.0 mL甲醇，50 ℃浸提30 min，提取3次。浸提液4 000 rpm/min離心15 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液用甲醇定容至5.0 mL，得麥麩提取物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以黑曲霉、泡盛曲霉為發(fā)酵菌種，設(shè)定麥麩5.0 g、（NH4）2SO4 16.0 mg/g麥麩、KH2PO4 mg/g麥麩、菌種比例1∶1、發(fā)酵時(shí)間6 d、含水量75%、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量1.0 mL（約1×107 個(gè)孢子/mL）為固定條件，分別研究麥麩添加量（2.5 g、5.0 g、7.5 g、10.0 g、15.0 g）、（NH4）2SO4含量（10.0 mg/g麥麩、13.0 mg/g麥麩、16.0 mg/g麥麩、19.0 mg/g麥麩、22.0 mg/g麥麩）、KH2PO4含量（0.6 mg/g麥麩、0.8 mg/g麥麩、1.0 mg/g麥麩、1.2 mg/g麥麩、1.4 mg/g麥麩）、菌種比例（2∶1、1∶1、1∶2）、發(fā)酵時(shí)間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、含水量（65%、70%、75%、80%、85%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、接種量（0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL、1.2 mL）等因素對發(fā)酵后提取物酚類含量的影響。

1.3.2 Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取各因素最優(yōu)值為Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中心點(diǎn)，優(yōu)化發(fā)酵工藝。誤差估計(jì)選取3個(gè)虛擬項(xiàng)、1個(gè)中心點(diǎn)。每個(gè)因素取2個(gè)水平，高水平編碼為+1，低水平編碼為-1。發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量（μg/g）作為響應(yīng)值Y，通過回歸分析和數(shù)據(jù)處理，共完成13次試驗(yàn)（表1）。

1.3.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基于Design Expert 12.0.3軟件分析各因素產(chǎn)生的影響效應(yīng)值，依序排列，篩選影響總酚含量的顯著因素完成最陡爬坡試驗(yàn)。以實(shí)驗(yàn)值的變化方向作為實(shí)驗(yàn)爬坡方向，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定步長，盡快逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化分析 基于最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件作為Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，基于Design Expert 12.0.3軟件完成三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法［16］測定麥麩提取物的總酚類物質(zhì)含量。沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，760 nm處測定吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.013x+0.019。準(zhǔn)確移取麥麩提取液100.0 μL，按照Folin-Ciocalteu法完成三次平行測量，根據(jù)回歸方程計(jì)算濃度值。

1.4.2 DPPH自由基清除率測定 取0.1 mL麥麩提取物，加入2.0 mL 6.25×10-5 mol/L DPPH甲醇溶液中，混勻后避光靜置反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度（A），此為測定組Ai；甲醇與DPPH混合溶液為對照組A0；甲醇與樣品混合溶液為空白組Aj［17］。以0.1 mg/mL的BHT溶液為陽性對照。計(jì)算自由基消除率（%）=＼[1-（Ai-Aj/A0）＼]×100。

1.4.3 總還原能力測定 試管中加入0.1 mL麥麩提取物，同時(shí)加入2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L， pH 6.6）和2.5 mL含量1%的鐵氰化鉀溶液。充分混勻后，50 ℃ 水浴20 min，加入2.5 mL 含量10%三氯乙酸，室溫靜置10 min。取2.5 mL反應(yīng)液，依次加入2.5 mL蒸餾水與0.5 mL含量0.1%氯化鐵溶液，充分混勻于室溫靜置10 min后，測定700 nm處的吸光度。陽性對照為0.1 mg/mL的BHT溶液［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測定不同發(fā)酵條件下麥麩提取物的總酚含量，以各因素總酚含量最高的條件為Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)（圖1）?？偡雍侩S麥麩添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，添加量7.5 g時(shí)總酚含量最高。（NH4）2SO4含量為16.0 mg/g麥麩、KH2PO4含量為1.2 mg/g麥麩時(shí)，產(chǎn)物總酚含量最高。黑曲霉和泡盛曲霉按1∶1比例發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物總酚含量最高?？偡雍侩S發(fā)酵時(shí)間延長呈先增加后降低趨勢，發(fā)酵3～5 d期間產(chǎn)物中總酚含量逐漸升高，第5 d總酚含量最高（P＜0.05），之后逐漸降低。培養(yǎng)基含水量為80%時(shí)總酚含量最高（1 988.49 μg/g）。發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，麥麩提取物總酚含量最高。不同混菌接種量對麥麩提取物的酚類含量有顯著影響，混菌接種量為1.0 mL時(shí)總酚含量最高，顯著高于其他條件（P＜0.05）。因此，確定Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)為：麥麩7.5 g、（NH4）2SO4含量16.0 mg/g麥麩、KH2PO4含量1.2 mg/g麥麩、含水量80%、黑曲霉與泡盛曲霉接種比例1∶1、接種量為1.0 mL（約1×107個(gè)孢子/mL）、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間5 d。

2.1.2 Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)（N=11）每組設(shè)置3個(gè)平行，以總酚含量為響應(yīng)值（Y）。由表3、表4可知，PB實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值為0.003 3，表明該模型具有良好的顯著性；接種量（H）、含水量（F）與（NH4）2SO4含量（B）對總酚含量有極顯著影響（P＜0.01，R2=0.981 4）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇接種量、含水量與（NH4）2SO4含量作為關(guān)鍵變量優(yōu)化以獲取最大響應(yīng)值。

2.1.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由于接種量、含水量、（NH4）2SO4含量均為顯著正效應(yīng)，故應(yīng)提高接種量、含水量及（NH4）2SO4含量，加大步長以逼近最佳區(qū)域，其他影響因素值選取PB實(shí)驗(yàn)總酚產(chǎn)量最高的條件。由表5可知，隨著接種量、含水量、（NH4）2SO4含量的增加，總酚含量先增高后降低，在路徑2時(shí)達(dá)到最高（2 327.63 μg/g）。表明顯著因素的最優(yōu)值接近路徑2實(shí)驗(yàn)值，即接種量1.0 mL、含水量80%、（NH4）2SO4含量16.0 mg/g麥麩，以此為Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.1.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì) 基于Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立回歸模型，完成方差分析（表6、表7）。模型相關(guān)系數(shù)為R2=0.986 9，說明該模型擬合度高，能很好地預(yù)測混菌固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的培養(yǎng)條件與總酚含量的關(guān)系。

2.1.5 確定最佳發(fā)酵工藝 由圖2可知，該模型最大值X1=1.1，X2=79.05，X3=17.0，此條件下響應(yīng)值Y為2 508.12。由此確定黑曲霉和泡盛曲霉共發(fā)酵麥麩的最優(yōu)條件為接種量1.1 mL、含水量 79.05%、（NH4）2SO4含量17.0 mg/g麥麩，理論預(yù)測優(yōu)化后培養(yǎng)基總酚含量為2 508.12 μg/g。

2.1.6 驗(yàn)證最佳發(fā)酵工藝 為確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，按最佳發(fā)酵工藝完成三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平均值為2 498.34 μg/g，與理論值接近，說明所構(gòu)建模型準(zhǔn)確可靠，證明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化泡盛曲霉和黑曲霉共發(fā)酵麥麩的方案可行。以優(yōu)化的最佳工藝發(fā)酵，麥麩提取物的總酚含量相比優(yōu)化前提高了35.12%。

2.2 單獨(dú)發(fā)酵與混合發(fā)酵總酚含量的比較

按照優(yōu)化后的最佳發(fā)酵工藝配置培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)基接種黑曲霉、泡盛曲霉及混合菌株的孢子懸液（約1×107個(gè)孢子/mL），29 ℃發(fā)酵6 d后提取有效成分，比較各組發(fā)酵后總酚含量。由圖3可知，黑曲霉與泡盛曲霉混合發(fā)酵后麥麩提取物總酚含量比其單獨(dú)發(fā)酵含量明顯增加（P<0.05），其中經(jīng)工藝優(yōu)化后混菌發(fā)酵的總酚含量（2 498.34 μg/g）最高，比混菌發(fā)酵工藝優(yōu)化前提高了35.12%，比黑曲霉、泡盛曲霉單獨(dú)發(fā)酵分別提高了45.76%、57.87%。這說明黑曲霉與泡盛曲霉的混合發(fā)酵有助于麥麩酚類物質(zhì)的釋放，進(jìn)而提高總酚的提取率，經(jīng)工藝優(yōu)化總酚含量顯著提高（P<0.05）。

2.3 抗氧化性能測定

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，廣泛應(yīng)用于體外評價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化性，通過測定麥麩提取物對DPPH自由基的清除能力可評估其抗氧化性的強(qiáng)弱。由圖4（a）可知，由不同菌株發(fā)酵的DPPH自由基清除能力存在差異，其中混合菌株工藝優(yōu)化后發(fā)酵提取物的自由基清除率為76.27%，高于陽性對照BHT的清除率13.89%，比混菌發(fā)酵工藝優(yōu)化前提高了30.07%，比黑曲霉、泡盛曲霉單獨(dú)發(fā)酵分別提高了41.84%、53.64%。這表明優(yōu)化工藝后混合菌株發(fā)酵可顯著提高產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，與麥麩提取物的酚類含量具有相關(guān)性。

本試驗(yàn)比較不同菌株發(fā)酵提取物對鐵離子的還原力，吸光度值越大，則總還原力越強(qiáng)。以BHT為陽性對照，其吸光度為0.24，其他各組所測吸光度分別為0.18、0.17、0.19、0.26（圖4（b））。混合菌株優(yōu)化工藝后發(fā)酵提取物的總還原力，較優(yōu)化前增強(qiáng)36.84%，較黑曲霉、泡盛曲霉單獨(dú)菌株發(fā)酵結(jié)果分別增強(qiáng)44.44%、52.94%，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。這說明混合菌株優(yōu)化工藝后發(fā)酵產(chǎn)生的物質(zhì)具有更強(qiáng)的還原能力，與DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論

混菌固態(tài)發(fā)酵可充分利用不同菌株產(chǎn)生酶種類的協(xié)同作用，促使混菌間互利共棲，發(fā)酵產(chǎn)物更為豐富；同時(shí)借助菌種之間的共生作用，減少中間產(chǎn)物過大對發(fā)酵產(chǎn)物生成的負(fù)面影響，有助于增強(qiáng)混菌發(fā)酵能力，提高生產(chǎn)率［19］。采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵麥麩，獲得了產(chǎn)量較高且具有體外抗氧化和益生活性的阿魏酸糖酯［20］，拓寬麥麩再利用思路。目前麥麩發(fā)酵釋放酚類的研究主要側(cè)重單菌株發(fā)酵或液體發(fā)酵，效率較低。泡盛曲霉以固液混合方式發(fā)酵麥麩，發(fā)酵浸提液的總酚含量為1 430.2 μg/g［21］。采用黑曲霉連續(xù)7 d固態(tài)發(fā)酵麥麩產(chǎn)阿魏酸等酚類物質(zhì)，發(fā)酵至第3 d時(shí)麥麩中總酚含量達(dá)到2 400 μg/g，但發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除率較低；隨著發(fā)酵時(shí)間延長，黑曲霉又成為阿魏酸的呼吸碳源，導(dǎo)致總酚含量最終下降［22］。本文采用黑曲霉與泡盛曲霉混合固態(tài)發(fā)酵麥麩釋放酚類活性物質(zhì)，經(jīng)過優(yōu)化麥麩發(fā)酵總酚含量為2 498.34 μg/g，同時(shí)含有較高的自由基清除率，顯著高于黑曲霉、泡盛曲霉單獨(dú)發(fā)酵。黑曲霉與泡盛曲霉混合發(fā)酵不僅促使麥麩的部分束縛型酚類物質(zhì)被釋放，提高了酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，而且共發(fā)酵所得組分具有更高的生物活性。但由于麥麩中酚類物質(zhì)成分復(fù)雜，如何促進(jìn)麥麩中酚類物質(zhì)的完全釋放還需深入研究。

4 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化混合菌株發(fā)酵麥麩的工藝條件，綜合考慮發(fā)酵相關(guān)因素，得到最佳發(fā)酵條件：麥麩10.0 g、（NH4）2SO4含量17.0 mg/g麥麩、KH2PO4含量1.8 mg/g麥麩、含水量79.05%、黑曲霉與泡盛曲霉接種比例1∶1、接種量為1.1 mL（約1×107個(gè)孢子/mL）、發(fā)酵溫度29 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d。實(shí)驗(yàn)表明，黑曲霉與泡盛曲霉混合發(fā)酵麥麩，能有效促進(jìn)麥麩中酚類物質(zhì)的釋放，顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量及抗氧化活性，為酚類物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供新資源。

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