劉天 張思琦 張志強(qiáng) 周永康 程立偉

【摘 要】 目的：建立醋雞內(nèi)金配方顆粒特征圖譜及指標(biāo)成分含量測定方法。方法：采用ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以甲醇-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min→0.5 mL/min→0.8 mL/min→1.0 mL/min→1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm。運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件對樣品進(jìn)行相似度評價(jià)，并確定共有峰。結(jié)果：建立的醋雞內(nèi)金配方顆粒的特征圖譜及指標(biāo)成分含量測定方法符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。尿苷和鳥苷的進(jìn)樣量分別在0.0140～0.2799 μg、0.0106～0.2121 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。平均回收率分別為98.3%、103.1%。測定的7批醋雞內(nèi)金配方顆粒特征圖譜相似度均>0.900，共標(biāo)定了9個(gè)特征峰，并指認(rèn)出其中4個(gè)成分，分別為：尿嘧啶、尿苷、腺苷和鳥苷。結(jié)論：該方法簡便，準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，可用于醋雞內(nèi)金配方顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 醋雞內(nèi)金；配方顆粒；特征圖譜；高效液相色譜法；質(zhì)量控制

【中圖分類號】?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）03-0023-05

Establishment of Characteristic Chromatogram Combined with Content Determination

of Target Components in Vinegar-Processed Gallus Gallus Domesticus Formula Granules

LIU Tianyi1，2，3 ZHANG Siqi1，2，3 ZHANG Zhiqiang1，2，3* ZHOU Yongkang1，2，3 CHENG Liwei1，2，3

1. Beijing Tcmages Pharmaceutical Co.， Ltd， Beijing 101301， China;

2.National and Local Joint Engineering Research Center for Key Technologies of Chinese

Medicinal Composition Granules， Tianjin 301700， China;

3.Beijing Engineering Technology Research Center for Chinese Medicinal Composition Granules， Beijing 101301， China

Abstract：Objective To establish a method for characteristic chromatogram and target components determination of Vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules. Methods The determination was performed on Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column; the gradient elution solvent system was composed of methanol-0.2% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 mL/min→0.5 mL/min→0.8 mL/min→1.0 mL/min→1.0 mL/min; the column temperature was set at 35 ℃， and detection wavelength was set at 254 nm. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to evaluate the similarity and to confirm common peaks.Results The validation results showed that the method could be used for characteristic chromatogram and target components determination of vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules. Uridine and guanosine had a good linearity within the range of 0.0140-0.2799 μg， 0.0106-0.2121 μg， respectively．The average recovery of uridine and guanosine was 98.3%， 103.1%， respectively. Nine common peaks were identified with similarity more than 0.900 in 7 batches of vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules， and four of those were identified as uracil， uridine， adenosine， guanosine.Conclusion This simple method has good repeatability and stability， which can be used for quality evaluation of Vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules.

Keywords：Vinegar-Processed Gallus Gallus Domesticus; Formula Granules; Characteristic Chromatogram; HPLC; Quality Control

醋雞內(nèi)金為雉科動(dòng)物家雞Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊內(nèi)壁，照清炒法（通則0213）炒至鼓起，噴醋，取出，干燥而得［1］。醋雞內(nèi)金作為雞內(nèi)金最常見的炮制品之一，在臨床上應(yīng)用廣泛，具有健胃消食、固精止遺、活血通經(jīng)等功效，常用于治療小兒傷食、腹瀉、遺尿、遺精、膽道結(jié)石及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病［2-4］。醋炙能夠使雞內(nèi)金質(zhì)地酥脆，有利于粉碎及其有效成分的煎出，同時(shí)矯正了不良?xì)馕?，使其更易于病人接受?-7］。

醋雞內(nèi)金配方顆粒是以雞內(nèi)金藥材為原料，經(jīng)過水提、固液分離、濃縮、干燥、制粒等工序加工制成的供中醫(yī)臨床配方使用的顆粒劑。配方顆粒在使用過程中既能保持中醫(yī)傳統(tǒng)的君、臣、佐、使和辨證論治、靈活加減的特點(diǎn)，又免去了傳統(tǒng)中藥飲片煎煮的麻煩，更有利于患者服用［8］。醋雞內(nèi)金配方顆粒與雞內(nèi)金藥材相比失去了固有的外觀性狀，因此在鑒別方面更加有難度。2020年版《中華人民共和國藥典》中，雞內(nèi)金藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅包括性狀、檢查（水分、總灰分）和浸出物檢測項(xiàng)，對各主要成分的含量未做規(guī)定，無法實(shí)現(xiàn)對醋雞內(nèi)金配方顆粒質(zhì)量的準(zhǔn)確描述和評價(jià)［1］。要實(shí)現(xiàn)醋雞內(nèi)金配方顆粒的質(zhì)量可控、穩(wěn)定，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得尤為重要。醋雞內(nèi)金配方顆?；瘜W(xué)成分復(fù)雜，目前未見到詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道揭示其具體有效成分，質(zhì)量研究主要集中在其原料中蛋白質(zhì)、多糖、酶、氨基酸等成分［9-13］，而對于醋雞內(nèi)金配方顆粒中核苷類成分的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。核苷類成分是細(xì)胞的重要組成部分，對機(jī)體的免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，有益于小腸的生長發(fā)育、脂質(zhì)代謝，還能夠起到舒張血管、活化肝功能等藥理作用［14-16］，與醋雞內(nèi)金配方顆粒發(fā)揮健胃消食、固精止遺、活血通經(jīng)等功效具備一定關(guān)聯(lián)性。醋雞內(nèi)金配方顆粒是以水為溶劑提取加工而成，而其水溶性成分主要是核苷類成分。日前，《上海市中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)公示稿》公布了關(guān)于雞內(nèi)金配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)中以核苷類成分尿苷為指標(biāo)控制產(chǎn)品質(zhì)量，除此之外，以核苷類成分為指標(biāo)的中藥材相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)目前已有廣泛報(bào)道［17-21］。因此，本文將核苷類成分作為醋雞內(nèi)金配方顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，并建立特征圖譜，以期為醋雞內(nèi)金配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY Arc型高效液相色譜儀（包括真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV檢測器；Empower色譜工作站，沃特世科技（上海）有限公司）；ML204T型電子天平（瑞士梅特勒·托利多公司）；XY2000-2C型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；MSA6.6S-0CE-DM型電子天平（賽多利斯科技儀器（北京）有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；THZ-82型恒溫水浴振蕩器（金壇市精達(dá)儀器制造有限公司）等。

1.2 材料 尿苷（批號：110887-201803，純度：99.5%），鳥苷（批號：111977-201501，純度：93.6%），腺苷（批號：110879-201703，純度：99.7%），尿嘧啶（批號：100469-201302，純度：99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。醋雞內(nèi)金配方顆粒S1～S7（批號：21007561、J2002390、18011561、21007021、21009061、20045321、20009221）由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，雞內(nèi)金藥材（批號：202105-1-12）醋雞內(nèi)金飲片（批號：202104-4-10）經(jīng)北京康仁堂藥業(yè)有限公司于立偉老師鑒定為雉科動(dòng)物家雞Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊內(nèi)壁，醋雞內(nèi)金飲片由炮制車間提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（250mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%磷酸水（B）。梯度洗脫0～13 min：0～5%甲醇，流速1.0～0.5 mL/min；13～15 min：5～10%甲醇，流速0.5～0.8 mL/min；15～55 min：10～60%甲醇，流速0.8～1.0 mL/min；55～60 min：60%甲醇，流速1.0 mL/min。檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取尿苷、鳥苷、尿嘧啶和腺苷對照品適量，精密稱定，加入蒸餾水分別制成每1 mL含6 μg尿苷、10 μg鳥苷、4 μg尿嘧啶和4 μg腺苷的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40min，放冷，再次稱定重量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 色譜峰指認(rèn) 取上述對照品溶液及供試品溶液（批號：21007561）按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，醋雞內(nèi)金配方顆粒供試品中色譜峰1、峰2、峰3、峰4分別與對照品溶液尿嘧啶、尿苷、腺苷、鳥苷色譜峰相對應(yīng)。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取醋雞內(nèi)金配方顆粒（批號：21007561）0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以4號鳥苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對保留時(shí)間的RSD為0.10%～1.30%，相對峰面積的RSD為0.99%～1.50%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取醋雞內(nèi)金配方顆粒（批號：21007561）6份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以4號鳥苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.02%，相對峰面積的RSD為0.15%～1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取醋雞內(nèi)金配方顆粒（批號：21007561）供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以4號鳥苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.02%，相對峰面積的RSD為0.26%～0.59%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 樣品相似度評價(jià) 取7批醋雞內(nèi)金配方顆粒S1～S7，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色圖譜。使用“中藥色譜特征圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012版），以S1圖譜作為參照圖譜，采用中位數(shù)對照譜圖生成法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，生成醋雞內(nèi)金配方顆粒的對照圖譜R，計(jì)算相似度評價(jià)結(jié)果。結(jié)果顯示，建立的特征圖譜共有9個(gè)特征峰，如圖2所示。以4號鳥苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算7批醋雞內(nèi)金配方顆粒中各特征峰的相對保留時(shí)間，RSD為0.06%～1.04%，由此可見，建立的特征圖譜各特征峰出峰時(shí)間較穩(wěn)定。S1～S7批次醋雞內(nèi)金配方顆粒與對照圖譜R的相似度分別為0.971、0.997、0.939、0.998、0.947、0.981、0.990，均大于0.900，符合特征圖譜分析要求。

2.5 含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取尿苷和鳥苷對照品7.033 mg和5.664 mg于250 mL容量瓶中，加入蒸餾水使溶解并定容至刻度得到混合對照品溶液⑤，精密吸取混合對照品溶液⑤0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得一系列不同濃度的混合對照品溶液①～④。將以上不同濃度的混合對照品溶液①～⑤按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表1。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取6.32 μg/mL尿苷對照品溶液和9.37 μg/mL鳥苷對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定尿苷峰面積為：246592、247577、246890、246325、247330，鳥苷峰面積為：285958、286045、286458、287740、288153，計(jì)算尿苷峰面積RSD為0.21%（n=5），鳥苷峰面積RSD為0.35%（n=5），表明該系統(tǒng)的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取醋雞內(nèi)金配方顆粒（批號：21007561）6份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得到尿苷和鳥苷平均含量分別為0.56 mg/g、0.45 mg/g，RSD分別為0.24%、0.31%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取醋雞內(nèi)金配方顆粒（批號：21007561）供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得到尿苷和鳥苷峰面積的RSD分別為0.19%和0.22%，結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取醋雞內(nèi)金配方顆粒（批號：21007561）9份，每份0.25 g，精密稱定，分別精密加入不同濃度的混合對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.5.6 樣品含量測定 取7批醋雞內(nèi)金配方顆粒（S1～S7），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得到尿苷平均含量分別為0.56 mg/g、0.50 mg/g、0.35 mg/g、0.49 mg/g、0.91 mg/g、0.52 mg/g、0.56 mg/g；鳥苷平均含量分別為0.45 mg/g、0.38 mg/g、0.36 mg/g、0.39 mg/g、0.85 mg/g、0.42 mg/g、0.64 mg/g。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了不同型號的色譜柱的分離效果，包括ZORBAX SB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect HSS T3（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和Waters Symmetry C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）色譜柱，結(jié)果供試品在以上色譜柱上均能得到較好的分離，在ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱上峰形更優(yōu)。

本實(shí)驗(yàn)比較了固定波長254 nm、360 nm和280 nm對色譜圖的影響，結(jié)果顯示，在254 nm波長下，特征圖譜信息豐富，指標(biāo)成分色譜峰響應(yīng)值較高，且各特征峰之間分離度較好，基線較平穩(wěn)。

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水4種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水時(shí)，獲得了更好的峰形，各色譜峰分布均勻?？疾熘鶞兀?3 ℃、35 ℃、37 ℃）對色譜分離的影響，結(jié)果顯示，該方法對不同柱溫具有良好的耐用性。

3.2 供試品制備方法的考察 本實(shí)驗(yàn)對提取溶劑（蒸餾水、10%甲醇、30%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、10%乙醇、30%乙醇、70%乙醇和90%乙醇）進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，以蒸餾水和10%甲醇作為提取溶劑時(shí)提取率較高，且各特征峰分離效果較好，從安全性和經(jīng)濟(jì)成本方面考慮選擇蒸餾水為提取溶劑；對提取方式（振搖、超聲和回流）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，三種方式均可將樣品提取完全，且特征圖譜無明顯差異，從操作簡便方面考慮選擇超聲為提取方式；最后對提取溶劑量（15 mL、25 mL、50 mL）和提取時(shí)間（20 min、40 min、60 min）進(jìn)行考察，結(jié)果當(dāng)提取溶劑量為50 mL，提取時(shí)間為40和60 min時(shí)均可將樣品提取完全，從時(shí)間成本考慮選擇提取溶劑量為50 mL，提取時(shí)間為40 min。

3.3 結(jié)果分析 本研究建立的醋雞內(nèi)金配方顆粒特征圖譜信息豐富，標(biāo)定共有峰9個(gè)，并準(zhǔn)確指認(rèn)出其中核苷類成分：尿苷、鳥苷、尿嘧啶和腺苷，有效提升了醋雞內(nèi)金配方顆粒特征圖譜的信息量，充分反映了其水溶性成分的特征性。多批次醋雞內(nèi)金配方顆粒特征圖譜相似度結(jié)果反映了醋雞內(nèi)金配方顆粒質(zhì)量較為穩(wěn)定，但是特征峰以外的其他色譜峰在不同批次間存在明顯差異，后續(xù)可進(jìn)一步研究產(chǎn)生差異性的成分及具體原因。與此同時(shí)，該方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對指標(biāo)成分尿苷和鳥苷的含量測定，為更加全面控制醋雞內(nèi)金配方顆粒的質(zhì)量提供參考。

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［20］何小翠，李軍，萬晶瓊，等.金蟬花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2021，32（5）：1143-1146.

［21］張勛，張嘉嘉，馬遲，等.HPLC法同時(shí)測定金線蓮中12個(gè)核苷類成分的含量［J］.藥物分析雜志，2020，40（7）：1197-1207.

（收稿日期：2022-06-02 編輯：劉 斌）