顧祥文 王強

摘要 以公共數(shù)據(jù)庫所有組裝完整的銅綠假單胞菌基因組為研究對象，針對其2個紅素氧還蛋白的編碼基因（rubA2和rubA1）及鑒定出的蛋白序列進行系統(tǒng)的演化分析。結果表明，其中一個紅素氧還蛋白的編碼基因來源于基因組中祖先基因的復制，而非其他物種的水平基因轉移。由于基因的功能分化，rubA2編碼的紅素氧還蛋白可能發(fā)揮電子傳遞以外的生物學功能，主要為DNA的轉錄和RNA的生成。該研究為微生物重要基因的演化和功能分化提供了參考，同時也揭示了一種銅綠假單胞菌增強侵染人類、牲畜和家禽能力的潛在機制。

關鍵詞 銅綠假單胞菌；基因復制；功能分化；演化分析；紅素氧還蛋白；電子傳遞系統(tǒng)

中圖分類號 Q36? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）12-0009-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.002

Evolutionary Analysis of Rubredoxin from Pseudomonas aeruginosa

GU Xiang-wen， WANG Qiang

（School of Life Sciences， Nanjing University， Nanjing， Jiangsu 210000）

Abstract Taking the all completely assembled P. aeruginosa genomes from public databases as the research object， a systematic evolutionary analysis was conducted on its two encoding genes for rubredoxins （rubA2 and rubA1） and the identified protein sequences.The results showed that one of the genes coding for rubredoxin originated from the duplication of an ancestral gene in the genome， rather than from the horizontal gene transfer of other species. Due to the functional differentiation of genes， the rubA2-encoded rubredoxin was likely to perform biological functions other than electron transfer， mainly for DNA transcription and RNA production. This study not only provides a reference for the evolution and functional differentiation of important microbial genes， but also reveals a potential mechanism for P. aeruginosa to enhance its infection ability to humans， livestock and poultry.

Key words Pseudomonas aeruginosa;Gene duplication;Functional differentiation;Evolutionary analysis;Rubredoxin;Electron transport system

作者簡介 顧祥文（1997—），男，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：植物與微生物的基因演化。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事植物的基因演化研究。

收稿日期 2022-08-23

銅綠假單胞菌是一種廣泛分布于土壤、動物、植物、臨床等其他環(huán)境的革蘭氏陰性菌［1］。作為醫(yī)院常見的條件致病菌之一，銅綠假單胞菌可能會引起泌尿道、呼吸道、燒傷創(chuàng)面和菌血癥等嚴重感染［2］。除了人類之外，在牛、豬、雞等牲畜和家禽中同樣分離出了具有致病性的銅綠假單胞菌，因此可能對畜牧業(yè)造成嚴重危害［3-5］。此外，銅綠假單胞菌也能夠利用代謝產物降解環(huán)境中的去污劑、原油等污染物［6-7］。銅綠假單胞菌的基因組大小約為6.3 Mbp，大于大多數(shù)細菌［8］。生存環(huán)境的多樣性和較大的基因組意味著該物種可能獲得了更多環(huán)境適應性相關的基因，這些基因可能來源于基因組中祖先基因的復制，也可能來源于其他物種的水平基因轉移［9］。

紅素氧還蛋白（rubredoxin）是細菌和古菌中發(fā)現(xiàn)的具有氧化還原活性的鐵硫蛋白，大小約為6 kD［10-11］。銅綠假單胞菌的2個紅素氧還蛋白分別由rubA2（PA5350）和rubA1（PA5351）編碼，它們是碳代謝相關的電子傳遞系統(tǒng)中的重要成員［12-13］。盡管已經(jīng)有研究解析了銅綠假單胞菌紅素氧還蛋白及其互作蛋白的晶體結構，并證明了電子傳遞系統(tǒng)對銅綠假單胞菌在具有正構烷烴的環(huán)境中生長的重要性［14］，但該系統(tǒng)可能還存在更加普遍的作用［15］。因此，研究銅綠假單胞菌2個紅素氧還蛋白的進化來源和潛在的功能差異，有助于更多地發(fā)掘電子傳遞系統(tǒng)在銅綠假單胞菌生長、代謝中的功能。該研究對銅綠假單胞菌的2個紅素氧還蛋白進行了系統(tǒng)的演化分析，推測了二者在進化上的起源，并在此基礎上通過共表達基因的功能聚類探究了銅綠假單胞菌2個紅素氧還蛋白的功能分化情況。

1 材料與方法

1.1 蛋白鑒定

于2022年3月從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）下載銅綠假單胞菌所有公開的菌株的基因組序列。紅素氧還蛋白（Pfam登錄號PF00301）的氨基酸序列分別通過HMMER 3.3.2的hmmsearch和hmmscan［16］在Pfam 35.0［17］中進行鑒定。將序列比對中的參數(shù)E值＜1×10-20的序列取交集合并。隨后，以E值＜1×10-5為閾值，連續(xù)進行多輪蛋白質Blast［18］，即將匹配到的序列作為下一輪的查詢序列，直到檢索不出新的序列。

1.2 進化樹的構建

通過hmmsearch鑒定出用于系統(tǒng)發(fā)育樹構建的120種細菌蛋白（bac120）［19］的氨基酸序列。用MUSCLE v3.8.1551［20］對bac120和鑒定出的紅素氧還蛋白序列進行比對，并用trimAl v1.4［21］修正基于bac120序列比對較差的區(qū)域。隨后使用FastTree v2.1.11［22］構建系統(tǒng)發(fā)育樹和蛋白進化樹，并用iTOL v6［23］對樹進行注釋。

1.3 泛基因組分析

通過PPanGGOLiN 1.2.78［24］對391株銅綠假單胞菌的基因組序列進行泛基因組分析，再通過Gephi 0.9.5［25］實現(xiàn)泛基因組圖的可視化。

1.4 基因島分析

于2022年3月從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載γ-變形菌綱中相應菌株的Genebank文件，用Clinker v0.0.23［26］進行序列比對并實現(xiàn)基因共線性與相似性的可視化。

1.5 dN/dS計算

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載所有銅綠假單胞菌菌株的2個紅素氧還蛋白的CDS序列。用MEGA X［27］的Nei-Gojobori（Jukes-Cantor校正）［28］法計算非同義替換率（dN）和同義替換率（dS），最終的dN/dS為每個菌株兩兩配對dN/dS的平均值。

1.6 加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）

銅綠假單胞菌PAO1在不同處理條件下的轉錄組數(shù)據(jù)集從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫和假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.pseudomonas.com/）下載。由于不同數(shù)據(jù)集在數(shù)據(jù)量和測序深度上存在差異，因此僅從23個歸一化的GDS數(shù)據(jù)集中選取15個有GSE原始數(shù)據(jù)的進行后續(xù)分析。用R語言affy軟件包［29］中的函數(shù)RMA對GSE原始數(shù)據(jù)進行標準化。203個樣本按照處理條件分成40個測試組，經(jīng)過3個-3個隨機配對，共得到64 000個條件組合。用R語言WGCNA軟件包［30］分別對2個不同的紅素氧還原蛋白基因進行共表達網(wǎng)絡分析。設定閾值＞μ+2σ以篩選出具有實際統(tǒng)計學意義的共表達基因。共表達基因通過DAVID 2021［31］進行聚類和注釋。

2 結果與分析

2.1 紅素氧還蛋白在細菌中的分布情況

為了從整體上了解紅素氧還蛋白在細菌中的存在情況，首先選取了來自厚壁菌門、放線菌門、衣原體門和變形菌門中15個模式生物的典型菌株，從中共鑒定出12個紅素氧還蛋白。分別構建了這15個模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹和紅素氧還蛋白的進化樹（圖1）。紅素氧還蛋白主要存在于變形菌門中，而在厚壁菌門的3個菌株中均不存在。銅綠假單胞菌PAO1中鑒定出2種不同的紅素氧還蛋白。

隨后，以假單胞菌屬為重點關注對象，系統(tǒng)地鑒定了紅素氧還蛋白在銅綠假單胞菌所在的γ-變形菌綱中的存在情況。γ-變形菌綱的43個科中，有20個科鑒定出了紅素氧還

蛋白，其中絕大多數(shù)科的紅素氧還蛋白的拷貝數(shù)都不大于1。

對于銅綠假單胞菌以外的假單胞菌物種，僅產堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、耳炎假單胞菌（Pseudomonas otitidis）和拉爾寬假單胞菌（Pseudomonas lalkuanensis）擁有3個拷貝，其他假單胞菌的拷貝數(shù)均小于2（表1）。

在391個完整組裝的銅綠假單胞菌菌株的基因組中，共鑒定出783個紅素氧還蛋白，它們平均分布在蛋白進化樹的2個分支上，即所有銅綠假單胞菌菌株穩(wěn)定擁有2個紅素氧還蛋白（圖2）。

2.2 銅綠假單胞菌2個紅素氧還蛋白的演化來源

首先，在銅綠假單胞菌物種水平內確定2個紅素氧還蛋白編碼基因在基因組上的穩(wěn)定性。除了最為典型的PAO1菌株外，額外選取了2個典型的銅綠假單胞菌菌株PA7和UCBPP_PA14，進行基因的相似性和共線性分析。不同菌株相同紅素氧還蛋白的相似性為100%，相鄰紅素氧還蛋白的相似性也高達82%，且其上下游基因具有極高的共線性（圖3）。

為了探究該現(xiàn)象在391個銅綠假單胞菌菌株中是否具有普遍性，還進行了銅綠假單胞菌的泛基因組分析，結果如圖4所示，紅色圓點表示的2個紅素氧還蛋白的上下游均為橙色圓點代表的“核心基因”，表明紅素氧還蛋白周圍不存在新獲得的基因。基因島分析和泛基因組分析的結果證明，在銅綠假單胞菌物種水平內，2個紅素氧還蛋白皆已穩(wěn)定地存在于基因組上，需要在更大范圍內進一步尋找基因的演化起源。

進一步構建了假單胞菌屬水平的系統(tǒng)發(fā)育樹和紅素氧還蛋白的進化樹（圖5）。一方面，盡管一些假單胞菌部分菌株的紅素氧還蛋白拷貝數(shù)＞1（表1），但其代表性菌株僅擁有單拷貝，說明大部分假單胞菌物種并非穩(wěn)定擁有2個紅素氧

還蛋白，體現(xiàn)了銅綠假單胞菌的特殊性；另一方面，雖然銅綠假單胞菌2個紅素氧還蛋白之間的相似性高達82%，但是rubA2位于進化樹中相對獨立的分支上，表明其序列與大部分假單胞菌的紅素氧還蛋白存在一定的差異，其蛋白功能可能也因此產生了分化。

為了進一步確認銅綠假單胞菌其中一個紅素氧還蛋白是否來源于其他物種的水平基因轉移，構建了整個γ-變形菌綱的紅素氧還蛋白的進化樹（圖6）。在圖6中綠色標注的假單胞菌屬的物種之間存在幾個來源于其他科的物種，可能作為水平基因轉移的來源。然而，進一步的基因島分析（圖7）表明銅綠假單胞菌的2個紅素氧還蛋白與這幾個物種唯一的紅素氧還蛋白相似程度幾乎相同（如0.78、0.76），而非其中一個拷貝與其他物種相似度較高，另一個則較低的情況。根據(jù)上述結果，銅綠假單胞菌其中一個紅素氧還蛋白的編碼基因來源于自身基因組中祖先基因的復制，而非其他物種的水平基因轉移。

2.3 銅綠假單胞菌2個紅素氧還蛋白的功能分化

重復基因是祖先基因在自然選擇壓力的驅動下，經(jīng)歷新功能化、亞功能化或無功能化后產生并在基因組中保留的［32］。計算了銅綠假單胞菌2個紅素氧還蛋白編碼基因的dN/dS以衡量它們受到的選擇壓力，發(fā)現(xiàn)二者的dN/dS頻率分布基本相同且均小于1（圖8A），表明2個編碼基因皆受到強烈的負選擇，在基因組中的存在較為穩(wěn)定，在生物體的進化過程中發(fā)揮十分重要的作用。dS的計算結果則進一步表明rubA2的進化速率快于rubA1（圖8B）。

為了進一步探究2個紅素氧還蛋白來源于祖先基因的新功能化、亞功能化還是無功能化，進行了加權基因共表達網(wǎng)絡分析，從16個公開的基因表達數(shù)據(jù)集中尋找2個紅素氧還蛋白的共表達基因。值得注意的是，二者分別尋找到94和80個共表達基因，但這其中僅有4個交集基因。GO分析結果（圖9）表明，rubA1負責離子與環(huán)狀化合物的結合；rubA2的功能則與rubA1有所不同，可能參與DNA的轉錄和RNA的生成。

因為蛋白的功能與蛋白結構有關，利用RoseTTAFold［33］預測了rubA1和rubA2編碼的紅素氧還蛋白的三維結構，二者幾乎完全一致（圖10）。查詢假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.pseudomonas.com/）得知，盡管rubA1和rubA2在銅綠假單胞菌的基因組上相鄰，但rubA2受到的轉錄調控可能不如rubA1完備（圖11）。因此，2個紅素氧還蛋白潛在的功能差異并不是蛋白結構的差異造成的，而可能是轉錄調控驅動的。

3 結論與討論

該研究嚴格鑒定了紅素氧還蛋白在γ-變形菌綱尤其是假單胞菌屬中的分布情況。隨后，通過系統(tǒng)發(fā)育樹和蛋白進化樹的構建、泛基因組分析及基因島分析證明了銅綠假單胞菌的其中一個紅素氧還蛋白編碼基因很大程度上可能來源于自身的基因復制，而非其他物種的水平基因轉移。共表達基因的GO分析結果表明，rubA1編碼的紅素氧還蛋白主要參與離子與環(huán)狀化合物的結合，而rubA2則可能參與DNA的轉錄與RNA的生成。考慮到假單胞菌屬水平的紅素氧還蛋白進化樹中，rubA2遠離大部分假單胞菌物種的紅素氧還蛋白，位于較為獨立的分支上，該研究認為rubA1編碼的紅素氧還蛋白保留了原有的功能，而rubA2編碼的紅素氧還蛋白則經(jīng)歷了對生物體有利的功能分化，從而使2個紅素氧還蛋白的編碼基因得以在基因組中共同保留。至于rubA2的GO功能聚類得到的基因數(shù)量較少，p值也大于rubA1，很可能是因為rubA2尚未形成完整的功能網(wǎng)絡。

至于研究過程中發(fā)現(xiàn)的擁有3個紅素氧還蛋白的耳炎假單胞菌、產堿假單胞菌和拉爾寬假單胞菌來源于石油或農藥污染的海洋或土壤，而耳炎假單胞菌則來源于臨床環(huán)境。因此，驅動紅素氧還蛋白基因復制的因素可能是多樣的，可能源自環(huán)境中越來越多有待降解的污染物，也可能源自臨床上抗生素的過度使用。

此前，曾有研究報道部分銅綠假單胞菌菌株通過水平基因轉移額外獲得了一個脂肪酶（LipC2）［34］。作為臨床常見的條件致病菌，更強的脂肪分解能力意味著銅綠假單胞菌獲得了更強的人體侵染毒力［34］。在該研究中，2個具有不同功能的紅素氧還蛋白完善了電子傳遞系統(tǒng)，從而使得銅綠假單胞菌能夠將人類、牲畜和家禽的脂肪分解生成的飽和脂肪酸更好地氧化分解為水和二氧化碳，并從中攝取該反應釋放的大量能量，進一步增強自身的侵染毒力。該研究不僅為微生物重要基因的演化起源和功能分化的相關研究提供參考，同時也揭示了銅綠假單胞菌增強侵染毒力的潛在機制。作為臨床和畜牧環(huán)境中常見的致病菌，更加深入地了解銅綠假單胞菌的侵染和致病機制，可以更好地指導預防和治理活動，降低其對于人體健康和畜牧產業(yè)造成的危害。

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