田甜 李軍喬 王鑫慈 曲俊儒

摘要 基于NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的蕨麻葉綠體基因組序列，利用REPuter軟件和MISA軟件分析其微衛(wèi)星分布規(guī)律。結(jié)果顯示，在葉綠體基因組中共檢測(cè)到34個(gè)散在重復(fù)序列，22個(gè)分布在LSC區(qū)，10個(gè)分布在IR區(qū)，2個(gè)分布在SSC區(qū)。使用MISA 共注釋到92個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每1 820 bp出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR主要分布在LSC區(qū)（79.07%），重復(fù)序列主要以單堿基為主，占總數(shù)量的86.05%。微衛(wèi)星長(zhǎng)度平均為12 bp，大多數(shù)長(zhǎng)度為10 bp，說明蕨麻中重復(fù)基元較短的微衛(wèi)星變異速率較快。

關(guān)鍵詞 蕨麻；葉綠體基因組；微衛(wèi)星

中圖分類號(hào) Q 943? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）12-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.021

Characterization Analysis of Microsatellite in Chloroplast of Potentilla anserina

TIAN Tian1，2，LI Jun-qiao1，2，WANG Xin-ci1，2 et al

（1.The College of Ecological Environment and Resources，Qinghai Minzu University，Xining，Qinghai 810007.2.Tibetan Plateau Juema Industry Research Institute，Xining，Qinghai 810007）

Abstract The chloroplast genome sequences of Potentilla anserina L. was used to analyze the distribution of microsatellite from Gen Bank Database.It was analyzed with bioinformatics software REPuter and MISA.The results showed that it owned a total of 34 dispersed repetitive sequence in the chloroplast genome of Potentilla anserina L.，mainly distributed in the large single-copy region and Inverted repeat，22 and 10 respective，the small single-copy region merely 2.Using the MISA found 92 microsatellites in the chloroplast genome of Potentilla anserina L.One SSR locus per 1 820 bp.Mainly distributed in the large single-copy region （79.07%），the most commom repeat type of the cpSSR is mononucleotide repeat which accountede for 86.05%.The average length of SSR is 12 bp，mainly concentrated in 10 bp，which suggested that the shorter length of SSR in Potentilla anserina L.is change faster.

Key words Potentilla anserina L;Chloroplast genome;SSR

基金項(xiàng)目 青海省重點(diǎn)研發(fā)與轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目（2022-NK-120）；青海民族大學(xué)2021年研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（954M2021005）。

作者簡(jiǎn)介 田甜（1997—），女，貴州銅仁人，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源開發(fā)與利用。*通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。

收稿日期 2023-01-08

蕨麻（Potentilla Anserina L.），是薔薇科（Rosaceae）鵝絨委陵菜的一個(gè)變種，在我國(guó)西部地區(qū)尤其是青藏高原地區(qū)因塊根膨大而被稱為蕨麻，亦稱“人參果”［1］。蕨麻地上和地下部分均有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是地下塊根部分，研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻塊根中含有黃銅、鞣質(zhì)、多糖、皂苷等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗凝血、抗氧化、健脾益胃等作用［2］；地上部分含有粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維等成分［3］。因此，蕨麻可作為青藏高原優(yōu)質(zhì)藥食兩用植物資源。劉素君等［4］通過提取蕨麻多糖，將其作用于人肝瘤SMMC-7721細(xì)胞的體外增殖抑制作用，結(jié)果表明，蕨麻多糖對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用最高可達(dá)43.57%，同時(shí)對(duì)T-淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬率有顯著提高，說明蕨麻多糖在腫瘤的治療上有很大作用；Chen等［5］研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻可以有效增加免疫細(xì)胞數(shù)量，從而達(dá)到增強(qiáng)免疫力的效果。在日常飲食中，西部地區(qū)尤其是高原地區(qū)農(nóng)牧民，經(jīng)常用蕨麻熬粥，以此來提高免疫力和抗缺氧能力，且效果顯著。目前，對(duì)于蕨麻的研究大多集中在成分提取、品種選育及藥用價(jià)值等方面，較少有在分子水平上的研究報(bào)道［2-3，6-7］。2022年5月Tang等［8］對(duì)蕨麻葉綠體全基因組完成了測(cè)序（NCBI接收號(hào)：MW174249.1），并分析了序列結(jié)構(gòu)，而筆者在此基礎(chǔ)上，對(duì)葉綠體中的微衛(wèi)星進(jìn)行進(jìn)一步分析，為后續(xù)物種的品種鑒定、種質(zhì)遺傳多樣性及序列引物設(shè)計(jì)等奠定基礎(chǔ)。

葉綠體微衛(wèi)星（chloroplast microsatellite）又稱葉綠體SSR（chloroplast simple sequence repeats，cpSSR），分布在葉綠體上的長(zhǎng)度不超過200 bp的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，它既有微衛(wèi)星含有較多遺傳信息的特點(diǎn)［9］，又具備了葉綠體基因組進(jìn)化速率適中且穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點(diǎn)［10］，常被用于物種進(jìn)化水平、群體遷移等相關(guān)研究［11-12］，因此被廣泛應(yīng)用。王崇等［13］利用cpSSR對(duì)104個(gè)甘薯品種成功構(gòu)建了指紋圖譜；韓巖［14］利用7對(duì)cpSSR引物對(duì)三七居群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，明確了居群之間的遺傳性；李航等［15］用cpSSR和nSSR標(biāo)記明確了地方柑橘“枳雀”的親本和來源。cpSSR在種質(zhì)資源的開發(fā)與利用、物種遺傳、品種鑒定以及序列引物設(shè)計(jì)等方面都發(fā)揮著巨大用處。筆者利用NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的蕨麻葉綠體基因組數(shù)據(jù)，分析其微衛(wèi)星序列的分布、組成、長(zhǎng)度等特征，以期為后續(xù)蕨麻cpSSR遺傳多樣性研究以及引物序列設(shè)計(jì)研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫下載蕨麻（Potentilla anserina）的葉綠體基因組完整序列數(shù)據(jù)和注釋文件（NCBI接收號(hào)：MW174249.1）［8］，分別以.fasta和gb格式保存。

1.2 試驗(yàn)方法

使用REPuter［16］在線軟件，參數(shù)設(shè)置如圖1所示，分析蕨麻葉綠體基因組中的序列，對(duì)各散在重復(fù)序列位點(diǎn)所處的基因位置等分布信息進(jìn)行分析；使用MISA（MIcroSAtellite identification tool，MISA，https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）［17］分析蕨麻葉綠體基因組中的序列，設(shè)置參數(shù)：?jiǎn)螇A基重復(fù)次數(shù)為12次以上，二堿基重復(fù)次數(shù)為6次以上，三堿基重復(fù)次數(shù)為4次以上，四堿基、五堿基以及六堿基重復(fù)次數(shù)都在3次以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕨麻葉綠體基因組重復(fù)序列

基于REPuter程序，檢測(cè)到蕨麻葉綠體基因組上共有34個(gè)散在重復(fù)序列，分為Forward（F），Palindromic（P），Complement（C）3種類型，分別占比52.94%、44.12%和2.94%（表1）。

從圖2可知，重復(fù)序列有22個(gè)在LSC區(qū)，占比64.71%；IR區(qū)有10個(gè)，占比29.41%；SSC區(qū)只有2個(gè)，占比5.88%。Palindromic在LSC區(qū)、IR區(qū)、SSC區(qū)分別有9、5和1個(gè)，F(xiàn)orward分別有12、5和1個(gè)；Complement在SSC區(qū)和IR區(qū)沒有分布，只在LSC區(qū)分布有1個(gè)?？梢姡貜?fù)序列雖然在3個(gè)區(qū)域都有分布，但分布不均勻。

2.2 蕨麻葉綠體基因組SSR

2.2.1 SSR位點(diǎn)分布。

使用MISA識(shí)別蕨麻葉綠體基因組中的SSR位點(diǎn)，結(jié)果顯示，在總長(zhǎng)為156 488 bp的葉綠體基因組中，共檢測(cè)出86個(gè)SSR位點(diǎn)（不含復(fù)合型的位點(diǎn)，若將其考慮在內(nèi)，則共有92個(gè)SSR位點(diǎn)），總長(zhǎng)為1 030 bp，占總基因組的0.66%，分布廣泛，從177～155 708 bp均有分布，平均每1 820 bp出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。其中，在LSC區(qū)、SSC區(qū)以及IR區(qū)分別分布有825、113和92 bp，分別占比80.10%、10.97%和8.93%。分析SSR數(shù)量比例結(jié)果顯示（表2），蕨麻中SSR主要分布在LSC區(qū)，其次為SSC區(qū)，IR區(qū)分布最少。

2.2.2 SSR堿基組成與豐度。

在蕨麻葉綠體SSR中，單堿基重復(fù)基序最多，有74個(gè)為單堿基，占總重復(fù)的80.43%，主要基序組成是A和T，分別有27個(gè)（36.49%）和45個(gè)（60.81%），以C和G為基序的只有2個(gè)，僅占2.7%。其次為四堿基，有8個(gè)，占總重復(fù)的8.70%，其中以AAAT/ATTT基序最多，占比50%。二堿基和三堿基的數(shù)量相同，均為5個(gè)，分別占5.43%，主要以A和T基序組成，不含G和C。SSR中未發(fā)現(xiàn)五堿基基序及以上堿基序列組成。通過計(jì)算，所有類型的SSR中，單堿基豐度最高，為482.45個(gè)/Mb；最低為二堿基和三堿基，均為35.50個(gè)/Mb（表3）。

2.2.3 SSR長(zhǎng)度與基序拷貝數(shù)分布。

由圖3可知，蕨麻葉綠體微衛(wèi)星長(zhǎng)度平均為12 bp，最長(zhǎng)為18 bp，最短為10 bp，12 bp的SSR數(shù)量最多，有24個(gè)，占比27.91%；其次為長(zhǎng)度為10 bp的SSR數(shù)量，有21個(gè)，占比24.42%；最少為16和18 bp，分別僅有1個(gè)，占比1.16%。

蕨麻葉綠體微衛(wèi)星拷貝數(shù)3～18不等，基序越長(zhǎng)，則拷貝數(shù)越少，序列數(shù)也越少（圖4）。單堿基拷貝數(shù)10～18均有分布，范圍最大，序列數(shù)隨著拷貝數(shù)的增大而減少，重復(fù)序列最多的是拷貝數(shù)為10的序列，共有22個(gè)（29.73%）；拷貝數(shù)為18的序列最少，僅有1個(gè)（1.35%）。二堿基拷貝數(shù)范圍比較窄，僅有6和7次拷貝，各有4和1個(gè)重復(fù)序列。三堿基和四堿基中拷貝數(shù)分別為4和3。從圖4可看出，拷貝數(shù)與序列數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

使用REPuter程序檢測(cè)出蕨麻葉綠體基因組中有34個(gè)散在重復(fù)序列，大部分分布在LSC區(qū)（22個(gè)），而分布在IR

區(qū)（10個(gè)）的比分布在SSC區(qū)（2個(gè)）多，可能為進(jìn)化過程中，為了提高遺傳效率，生物體保留較少，但重要的遺傳信息已達(dá)到高效遺傳的目的［18］，因此在IR區(qū)的分布比在SSC區(qū)更多。

使用MISA軟件在總長(zhǎng)為156 488 bp的蕨麻葉綠體基因組檢測(cè)出中有86個(gè)葉綠體微衛(wèi)星，平均每1 820 bp出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星，分布密度為576個(gè)/Mb。相對(duì)于其他植物，如狗棗獼猴桃（A.kolomikta）中平均每3 840 bp出現(xiàn)1個(gè)，分布密度273個(gè)/Mb［19］；小黨參（C.minima）中平均每5 839 bp出現(xiàn)1個(gè)，分布密度180個(gè)/Mb，以及秦嶺黨參（C.tsinlingensis）中平均每4 601 bp，分布密度228個(gè)/Mb出現(xiàn)1個(gè)［20］，蕨麻中葉綠體微衛(wèi)星數(shù)量仍占優(yōu)勢(shì)。

蕨麻cpSSR主要以單堿基為主，重復(fù)基序越長(zhǎng)，數(shù)量越少，這與序列的穩(wěn)定性有關(guān)［21］。分析SSR基序發(fā)現(xiàn)，主要以單堿基為主，尤其以A/T基序最多。在其他堿基重復(fù)類型中同樣以基序A和T最多。研究發(fā)現(xiàn)［22-23］，植物葉綠體基因組中的CpG甲基化極和T進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而使G和C含量變少，而A和T基序變多，同時(shí)，熱力學(xué)的穩(wěn)定也需要較少的GC含量來維持。蕨麻葉綠體基因組中，單堿基A/T基序占比97.30%；二堿基和三堿基中都是以基序A和T組成，而四堿基中只有2個(gè)含有基序C和G，其他都是基序A和T。紫花鳳梨（Tillandsia cyanea）［24］、蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）［25］、丹參（Asparagus officinalis）［26］等植物均以單堿基重復(fù)序列為主，且基序A和T為主要組成。

蕨麻葉綠體微衛(wèi)星長(zhǎng)度平均為12 bp，長(zhǎng)度為12 bp的重復(fù)序列數(shù)最多，其次為10 bp，二者共有45個(gè)，占比52.33%。長(zhǎng)度大于15 bp的只有4個(gè)，占比僅為4.65%。說明長(zhǎng)度越長(zhǎng)，微衛(wèi)星豐度呈反向趨勢(shì)。吳東洋等［19］研究認(rèn)為，基序長(zhǎng)度的變化可以反映出微衛(wèi)星序列失去或獲得重復(fù)基元的速率。一般認(rèn)為，當(dāng)基序長(zhǎng)度大于等于20 bp時(shí)，序列具有較好的多態(tài)性［27］。該研究中蕨麻葉綠體SSR長(zhǎng)度平均只有12 bp，且都在20 bp以下，這與微衛(wèi)星變異速率有關(guān)［19］。

微衛(wèi)星長(zhǎng)度與其選擇壓力呈正相關(guān)，與拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)。因此，在中長(zhǎng)短長(zhǎng)度的微衛(wèi)星中，其選擇壓力較少，拷貝數(shù)越多，因而變異速率也更為快速，更傾向于擴(kuò)張［28］；長(zhǎng)度較長(zhǎng)的微衛(wèi)星拷貝數(shù)較少，自身相對(duì)穩(wěn)定，變異速率也就相應(yīng)降低。

葉綠體微衛(wèi)星有進(jìn)化速率慢、穩(wěn)定且分子量小的優(yōu)點(diǎn)，可以為植物進(jìn)化速率研究等提供便利條件，因此，掌握物種中微衛(wèi)星的特征是前提。該研究分析蕨麻中葉綠體微衛(wèi)星的特征，可以為后續(xù)微衛(wèi)星引物開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為蕨麻種質(zhì)圖譜構(gòu)建、分子育種及品種鑒定等方面的研究提供理論基礎(chǔ)。

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