宋吉鵬 孫銀玲 丁純潔 鄭宏宇 趙娢 孫丹丹 陳麗艷

摘要 ［目的］對(duì)參豉中糖蛋白的提取工藝進(jìn)行考察，并對(duì)其纖溶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。［方法］以糖蛋白提取率為指標(biāo)，通過單因素法考察緩沖液、提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)其的影響，并運(yùn)用響應(yīng)面法分析優(yōu)化參豉糖蛋白的提取工藝，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定糖蛋白中多糖含量，SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳確定糖蛋白的分子量，利用瓊脂糖纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶活性。［結(jié)果］緩沖液、提取時(shí)間和料液比對(duì)糖蛋白提取率影響較大；響應(yīng)面法優(yōu)化獲得參豉糖蛋白的最佳提取工藝條件為Tris-Base-NaCl緩沖溶液（pH=8.04）、料液比1∶10（g∶mL），于4 ℃提取6 h，參豉糖蛋白提取率為4.85%，其中多糖含量為12.34%；SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，參豉糖蛋白分子量為4.1～27.0 kD；與豆豉糖蛋白相比，參豉糖蛋白纖溶活性提高了40.6%。［結(jié)論］經(jīng)驗(yàn)證利用響應(yīng)面法分析測(cè)得參豉糖蛋白與模型預(yù)測(cè)值接近，可用于參豉糖蛋白的提取，且參豉糖蛋白具有較高的纖溶活性，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 參豉；糖蛋白；提取工藝；優(yōu)化；響應(yīng)面法；蛋白質(zhì)分子量；纖溶活性

中圖分類號(hào) R 284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）12-0147-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.034

Study on Extraction Process Optimization and Fibrinolytic Activity of Glycoprotein from Ginseng-douchi

SONG Ji-peng，SUN Yin-ling，DING Chun-jie et al

（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin，Heilongjiang 150036）

Abstract ［Objective］ The extraction process of glycoprotein in ginseng-douchi was investigated，and its fibrinolytic activity was evaluated.［Method］Taking the glycoprotein extraction rate as an index， the effects of buffers， extraction temperature， solid-liquid ratio， extraction time and extraction times were investigated by one-way method， and optimize the extraction process of ginseng-douchi glycoprotein by the response surface method.The polysaccharide content in glycoproteins was determined by anthraconone-sulfuric acid method，the molecular weight of glycoproteins was determined by SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis， and its fibrinolytic activity was determined by agarose fibrin plate method.［Result］ The buffers， extraction time and solid-liquid ratio had a greater impact on glycoprotein extraction rate. The optimal extraction process conditions for obtaining ginseng-douchi glycoprotein were optimized by the response surface method：Tris Base NaCl buffer solution （pH=8.04）， solid-liquid ratio 1∶10 （g∶mL）， and extracted at 4 ℃ for 6 hours，the extraction rate of ginseng-douchi glycoprotein was 4.85%， and the polysaccharide content in ginseng glycoprotein was 12.34%. SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis results showed that the molecular weight of ginseng-douchi glycoprotein was 4.1-27.0 kD; compared with ginseng-douchi glycoprotein， the fibrinolytic activity of ginseng-douchi glycoprotein increased by 40.6%.［Conclusion］ After verification， the ginseng-douchi glycoprotein measured by the response surface method is close to the predicted value of the model， which can be used for the extraction of ginseng-douchi glycoprotein， and ginseng-douchi glycoprotein has a high fibrinolytic activity， which provides a basis for its application.

Key words Ginseng-douchi; Glycoprotein; Extraction process;Optimization;Response surface methodology; Protein molecular weight;Fibrinolytic activity

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U20A20400）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-21）；黑龍江省財(cái)政專項(xiàng)（CZKYF-2021A002）；黑龍江省衛(wèi)生健康委課題（20211313050162）。

作者簡(jiǎn)介 宋吉鵬（1997—），男，山東青島人，碩士研究生，研究方向：中藥生物工程。

收稿日期 2022-09-29；修回日期 2022-11-23

參豉是依據(jù)《圣濟(jì)總錄》中記載的阿膠飲方，以人參和黃豆作為發(fā)酵基質(zhì)，采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制成的新型豆豉。前期已對(duì)參豉發(fā)酵前后人參皂苷和異黃酮糖苷類成分的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)黃豆加入人參發(fā)酵后纖溶活性明顯升高，且具有降低血脂水平、調(diào)節(jié)脂質(zhì)紊亂的作用［1-3］。此外，人參和黃豆中分別含有約12%和30%的蛋白質(zhì)［4-5］，而蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中易被微生物分泌的蛋白酶降解為多肽而表現(xiàn)更好的生理活性。研究表明，80%以上蛋白質(zhì)為糖蛋白，糖蛋白是一種由多肽鏈和低聚糖鏈共價(jià)結(jié)合而成的生物大分子，具有抗凝、溶栓、降低膽固醇、抗氧化等生物活性［6］，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)參豉糖蛋白具有較高的纖溶活性，可能為其益氣活血作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此該研究對(duì)參豉糖蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其分子量及纖溶活性進(jìn)行考察，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1

試材。黃豆購(gòu)于和糧農(nóng)業(yè)有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為豆科植物大豆［Glycine max（L.）Merr.］的干燥成熟種子；人參（5年生）購(gòu)自吉林省百濟(jì)堂參業(yè)有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為五加科植物人參（Panax Ginseng C.A.Mey.）的干燥根。

1.1.2 試劑。Tris-Base，Biosharp公司；Tris-HCl、PBS，北京中杉金橋；瓊脂糖、蛋白非預(yù)染Marker，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；纖維蛋白原，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；凝血酶，中國(guó)食品藥品檢定研究院；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、小分子量蛋白凝膠制備試劑盒、高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠制備試劑盒、小分子蛋白凝膠制備試劑盒、2X Tricine上樣緩沖液、蛋白非預(yù)染Marker，上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備。FD-1D-80+型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康公司；042BR10580型電泳儀，Bio-Rad公司；BSA224S-CW型電子天平，北京奧利多斯科學(xué)儀器有限公司；S210-K型pH計(jì)，美國(guó)梅特勒-托利多公司；603BR1415型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；M200型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，瑞士Tecan公司；MF3型菌落分析儀，杭州迅數(shù)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 參豉的制備。參照孫銀玲等［7］關(guān)于參豉的制備方法，人參和黃豆的質(zhì)量比為1∶10，以人參水提液浸泡黃豆，待提取液吸收殆盡，滅菌后作為發(fā)酵基質(zhì)，接種枯草芽孢桿菌菌液，于28 ℃發(fā)酵96 h，即得參豉樣品，經(jīng)冷凍干燥、粉碎為粗粉，采用石油醚脫脂后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用水合茚三酮（bicinchoninic acid，BCA）法［8］測(cè)定糖蛋白的濃度，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋分別得到1 600、800、400、200、100、50、25 μg/mL的BSA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按試劑盒說明操作，于562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.000 5x+0.096 1（R2=0.995 9）。

1.2.3

參豉糖蛋白樣品濃度的測(cè)定。用生理鹽水將糖蛋白提取液稀釋20倍，按照“1.2.2”的方法及波長(zhǎng)檢測(cè)各樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖蛋白濃度并計(jì)算提取率。

糖蛋白提取率=V×C×Dm×1 000×100%

式中，V為樣品溶液的總體積（mL）；C為樣品糖蛋白濃度（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；m為稱取樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素考察糖蛋白提取率。

1.2.4.1 緩沖液對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。配制3種不同pH的緩沖溶液體系：Tris-HCl（25 mmol/L）-NaCl（50 mmol/L）（pH=5.90 mol/L）、PBS（10 mmol/L）（pH=7.30）、Tris-Base（25 mmol/L）-NaCl（50 mmol/L）（pH=8.04）。精密稱取參豉粗粉3份各1 g，分別加入3種緩沖液各10 mL，室溫浸提6 h，每15 min渦旋振搖一次，在室溫條件下于4 200 r/min離心10 min，取上清液再于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液即為參豉糖蛋白粗提液，檢測(cè)糖蛋白濃度，計(jì)算提取率，確定最佳提取緩沖溶液。

1.2.4.2 提取溫度對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。精密稱取參豉粗粉3份各1 g，加入“1.2.4.1”確定的最佳提取緩沖液，其他參數(shù)不變，分別于4、25、35、45、60 ℃提取6 h，確定最佳提取溫度。

1.2.4.3 料液比對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。在最佳提取緩沖液和提取溫度的條件下，考察料液比1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。根據(jù)確定的最佳提取緩沖液、提取溫度、料液比，考察提取1、6、18、24 h對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。

1.2.4.5 提取次數(shù)對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。在以上最優(yōu)參數(shù)的條件下，考察提取1和2次對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化參豉糖蛋白提取工藝［9］。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)參豉糖蛋白提取率有明顯影響的因素為因變量，包括提取緩沖液、提取時(shí)間和料液比，結(jié)合因變量水平覆蓋單因素的試驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表1），篩選參豉糖蛋白最佳提取工藝。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析［10］。

1.2.6

糖蛋白提取液中多糖含量測(cè)定［11］。精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，配制0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋為濃度0、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液，吸取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL置于10 mL具塞刻度試管中，加入0.2%蒽酮-硫酸4 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15 min，再于冷水中冷卻至室溫，放置10 min。于627 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=6.859 5x-0.073 4（R2=0.996 4）。

采用Sevage法［12］脫除糖蛋白提取液中蛋白質(zhì)，脫蛋白后的提取液中加入95%乙醇，調(diào)至溶液乙醇濃度為80%，4 ℃靜置過夜，抽濾，取沉淀，依次加入無水乙醇、丙酮洗滌，抽濾，沉淀，為粗多糖樣品，干燥后測(cè)定重量。

精密稱取干燥至恒重的粗多糖樣品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為0.1 g/L的粗多糖溶液。精密吸取粗多糖溶液1.0 mL測(cè)吸光度，由回歸方程計(jì)算樣品的多糖濃度和糖蛋白中多糖含量。

1.2.7 糖蛋白分子量的測(cè)定。采用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定糖蛋白分子量［13］，20%SDS-PAGE凝膠電泳，120 V條件下恒壓分離；12%Tricine-SDS-PAGE（小分子）凝膠電泳，4 ℃，150 V條件下恒壓分離，分離時(shí)要防止小分子蛋白溢出膠外。凝膠采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色液［14］染色24 h，7%醋酸乙醇溶液脫色至條帶清晰，使用Bio-Rad凝膠成像儀對(duì)凝膠進(jìn)行圖像采集分析。

1.2.8 纖溶活性評(píng)價(jià)。采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法［15］測(cè)定糖蛋白纖溶活性，配制酶活力分別為10、20、40、60、80 IU/mL尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，上樣量為10 μL，37 ℃恒溫孵育18 h。利用迅數(shù)菌落計(jì)數(shù)儀測(cè)量溶圈直徑，計(jì)算溶圈面積。以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液溶圈面積（y）為縱坐標(biāo)、酶活力（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.550 3x+180.43（R2=0.985 5）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各糖蛋白樣品纖溶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 緩沖液對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。從圖1可以看出，在其他提取條件一致的情況下，緩沖液Tris-HCl-NaCl（pH=5.90）、PBS（pH=7.30）和Tris-Base-NaCl（pH=8.04）的糖蛋白提取率分別為（1.39±0.03）%、（1.33±0.05）%和（3.90±0.02）%。Tris-Base-NaCl的糖蛋白提取率顯著高于Tris-HCl-NaCl和PBS這2種緩沖液的提取率（P<0.05）。Tris-Base-NaCl緩沖液的pH為8.04，表明提取的參豉糖蛋白主要為弱酸性糖蛋白。

2.1.2

提取溫度對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。從圖2可以看出，提取溫度為4、25、35、45和60 ℃時(shí)，參豉糖蛋白提取率分別為4.02%、3.60%、4.20%、3.80%和4.40%，各組間無顯著差異（P>0.05）。雖然60 ℃條件下參豉糖蛋白提取率最高，但經(jīng)檢測(cè)，該溫度下提取的參豉糖蛋白纖溶活性較低，為（1 146.59±33.78）IU/mL，而4 ℃時(shí)纖溶活性為（1 575.36±27.66）IU/mL，因此為保證參豉糖蛋白纖溶活性，選擇4 ℃條件下提取糖蛋白為佳。

2.1.3

料液比對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。從圖3可以看出，隨著料液比的增加，糖蛋白提取率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶5 時(shí)糖蛋白提取率最高，為（5.91±0.12）%，顯著高于其他各料液比的提取率（P＜0.05）；當(dāng)料液比為1∶15時(shí)提取率明顯降低，僅為（0.80±0.02）%，而當(dāng)料液比低于1∶5 時(shí)，緩沖液被參豉粉末吸收殆盡，影響后續(xù)糖蛋白的提取，故選用1∶5為最佳提取料液比。

2.1.4

提取時(shí)間對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響。從圖4可以看出，提取時(shí)間1 h時(shí)糖蛋白提取率為（4.80±0.01）%，明顯低于其他3組（P＜0.05）。提取時(shí)間6、18和24 h的糖蛋白提取率無顯著差異（P＞0.05），基于提取成本和提取效率，選擇6 h為最佳提取時(shí)間，糖蛋白提取率為（5.91±0.12）%。

2.1.5

提取次數(shù)對(duì)參豉糖蛋白提取率的影響?？刂品磻?yīng)條件：Tris-Base-NaCl提取緩沖液，提取溫度4 ℃、料液比1∶5、提取時(shí)間6 h，考察提取1和2次對(duì)糖蛋白提取率的影響。結(jié)果表明，提取1、2次的糖蛋白提取率分別為（4.91±0.12）%、（5.05±0.06）%。由于2次糖蛋白總提取率無明顯差異，且溶液體積大導(dǎo)致后續(xù)糖蛋白溶液脫鹽、濃縮過程耗時(shí)較久，故選擇提取次數(shù)為1次。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

以緩沖液（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為響應(yīng)變量，參豉糖蛋白提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 13軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

通過對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：糖蛋白提取率（Y）=4.44-0.003 8A-0.055 0B+0.648 2C+0.042 5AB-0.005 0AC-0.837 6BC-2.400 0A2-0.986 9B2-0.265 5C2。

回歸模型方差及結(jié)果見表3，整體模型P=0.001 9＜0.05（顯著），表明試驗(yàn)方法可靠；方程失擬項(xiàng)P=0.451 9，表明失擬項(xiàng)不顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)影響較??；R2=0.906 7，說明回歸模型與實(shí)測(cè)值擬合度較好。各因素的影響程度從大到小依次為C>B>A，即料液比>提取時(shí)間>緩沖液。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，A（緩沖液）、B（提取時(shí)間）對(duì)糖蛋白提取率的影響不顯著（P＞0.05），C（料液比）對(duì)糖蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05）；在二次項(xiàng)中A2影響極顯著（P＜0.01），B2影響顯著（P＜0.05）。該方程是參豉糖蛋白提取率與提取工藝各參數(shù)合適的數(shù)學(xué)模型，因此可使用該回歸方程進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。

根據(jù)回歸方程，固定三因素中任意一因素，其他兩因素兩兩交互作用影響參豉糖蛋白提取率，得到等高線平面圖及對(duì)應(yīng)響應(yīng)面圖（圖5～7）。響應(yīng)面分析圖中曲線趨勢(shì)圖及等高線圖可獲得各因素對(duì)糖蛋白提取率影響的顯著程度，曲線越陡峭，等高線越密集，說明該因素對(duì)糖蛋白提取率的影響越顯著。各因素交互作用顯著程度可通過等高線圖中心橢圓觀察，中心橢圓越接近圓形，交互作用越不顯著。二維等高線圖顯示，參豉糖蛋白提取率隨緩沖液、提取時(shí)間和料液比的變化而變化，并生成了相應(yīng)的三維響應(yīng)面，從而更好地確定3個(gè)變量對(duì)相應(yīng)變量的交互關(guān)系［16］。等高線近橢圓形或近圓形，表明A（緩沖液）、B（提取時(shí)間）、C（料液比）對(duì)糖蛋白提取率存在影響，且料液比的影響作用大于緩沖液和提取時(shí)間（PC=0.022 7、PA=0.985 9、PB=0.822 2）。

利用Design-Expert 13.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化分析，得到預(yù)測(cè)的參豉糖蛋白提取最佳工藝條件為采用Tris-Base-NaCl（pH=8.04）緩沖液，按照料液比1∶10（g∶mL）于4 ℃提取6 h，此時(shí)參豉糖蛋白提取率為4.91%。驗(yàn)證試驗(yàn)的提取工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值，得到參豉糖蛋白提取率為4.85%，與預(yù)測(cè)值總體吻合，說明模型能較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)參豉糖蛋白提取率，優(yōu)化工藝條件較可靠。

2.3 參豉糖蛋白中多糖含量

測(cè)定多糖溶液吸光度后，通過回歸方程計(jì)算可得參豉糖蛋白提取液中多糖含量占參豉糖蛋白總量的12.34%，表明提取的參豉糖蛋白中含有少量的多糖。

2.4 SDS-PAGE及Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析

由圖8可知，人參糖蛋白分子量大部分為25 kD及以

上，而黃豆糖蛋白濃度較高，糖蛋白分子量在10～180 kD均有分布；在發(fā)酵過程中，微生物分泌的酶對(duì)人參及黃豆中的

糖蛋白進(jìn)行降解，使發(fā)酵后的豆豉糖蛋白及參豉糖蛋白分子量降低，在Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳中可以觀察到豆豉糖蛋白及參豉糖蛋白條帶，分子量均在66 kD以下，參豉可能由于加入人參共同發(fā)酵的原因，其糖蛋白分子量較豆豉糖蛋白分子量更小，分子量均在27 kD以下。

SDS-PAGE凝膠電泳用于分析相對(duì)分子量為20～100 kD的樣品，而Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，利用三羥甲基氨基甘氨酸（tricine）代替甘氨酸，分離膠中添加甘油，采用Tris-Tricine系統(tǒng)，增加了聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，能夠有效分離分子質(zhì)量小于10 kD的小分子蛋白和多肽［17］。羅浩銘等［18］研究報(bào)道人參糖蛋白分子量主要集中在35～75 kD，夏秀芳等［19］研究報(bào)道黃豆糖蛋白分子量分布在35 kD以上，且多數(shù)大于75 kD，與該研究凝膠電泳結(jié)果基本一致。黃豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，糖蛋白類成分發(fā)生降解，其分子量降低，多分布在20～66 kD，參豉糖蛋白的分子量小于豆豉糖蛋白，在4.1～27.0 kD，推測(cè)是人參與黃豆共同發(fā)酵，在微生物的作用下糖蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而具有更好的活性。

2.5 不同糖蛋白樣品纖溶活性對(duì)比分析

由于參豉是由人參與黃豆共同發(fā)酵制成，該研究同法提取人參、黃豆、豆豉（與參豉相同發(fā)酵條件，未加人參提取液）及參豉的糖蛋白并對(duì)比其纖溶活性，結(jié)果如圖9所示。從圖9可以看出，人參糖蛋白、黃豆糖蛋白未見纖溶活性，豆豉糖蛋白、參豉糖蛋白均有明顯的纖溶溶圈，纖溶活性分別為（1 154.28±37.86）和（1 623.04±29.93）IU/mL，參豉糖蛋白纖溶活性較豆豉糖蛋白提高了40.6%，表明發(fā)酵后糖蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而具有明顯的纖溶活性。

已有研究表明，人參蛋白有明顯的降血脂作用［20-21］，大豆發(fā)酵制成豆豉后蛋白質(zhì)含量明顯升高，并產(chǎn)生一種具有溶栓作用且安全無毒的豆豉纖溶酶［22-23］。前期研究表明，參豉具有明顯的纖溶活性［2］，但尚不清楚產(chǎn)生纖溶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。該研究結(jié)果初步證實(shí)了參豉糖蛋白是其具有纖溶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，且糖蛋白是生物體內(nèi)重要的生物大分子之一，廣泛存在于動(dòng)物、植物和某些微生物中，具有廣泛的藥理活性［24］；參豉糖蛋白的纖溶活性較豆豉高，可能是由于糖蛋白的分子量及結(jié)構(gòu)不同而使兩者活性產(chǎn)生差異。

3 結(jié)論與討論

該研究以糖蛋白提取率為指標(biāo)，通過單因素法考察緩沖液、提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)其的影響，結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)參豉糖蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)參豉糖蛋白的分子量和纖溶活性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，緩沖液、提取時(shí)間和料液比對(duì)糖蛋白提取率影響較大，響應(yīng)面法優(yōu)化獲得參豉糖蛋白的最佳提取工藝條件為Tris-Base-NaCl緩沖溶液（pH=8.04）、料液比1∶10（g∶mL），于4 ℃提取6 h，參豉糖蛋白提取率為4.85%，其中多糖含量為12.34%；SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，參豉糖蛋白分子量為4.1～27.0 kD；與豆豉糖蛋白相比，參豉糖蛋白纖溶活性提高了40.6%。

該研究采用單因素結(jié)合響應(yīng)面法確定了參豉糖蛋白的最佳提取工藝，通過纖溶活性評(píng)價(jià)證明了參豉糖蛋白是參豉具有纖溶活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，并明確了參豉糖蛋白的分子量范圍，為其進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供依據(jù)。

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