宋雙龍,王 石

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 普外科,河南 鄭州450003; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽胰脾外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特010110)

肝門部膽管癌(Hilarcholangiocarcinoma,HCCA)有較高的發(fā)病率,具有位置比較特殊、起病隱匿、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn),HCCA的診斷和治療一直是外科學(xué)的難題之一[1]。由于癥狀的遲發(fā)和缺乏有效的治療,疾病診斷后的平均存活率仍低于1年[2]。波形蛋白(Vimentin,VIM)是廣泛表達(dá)于細(xì)胞和組織中的一種Ⅲ型中間絲纖維蛋白[3]。VIM作為一種細(xì)胞骨架和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的一種關(guān)鍵標(biāo)志物,與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移以及侵襲能力密切相關(guān),并且會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞EMT的過(guò)程和轉(zhuǎn)移[4-5]。本文探討VIM在HCCA病情進(jìn)展中的意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

肝門部膽管癌QBC939細(xì)胞由課題組前期購(gòu)買,于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院科研中心保存。

1.2 試劑

BI公司的胎牛血清及細(xì)胞培養(yǎng)基;吉瑪基因設(shè)計(jì)并合成的siRNA序列;生工生物公司合成設(shè)計(jì)的引物序列;全式金公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)以及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒等。

1.3 動(dòng)物種系

SPF級(jí)BALB/c-Nude雌性裸鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)QBC939細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及傳代,使用脂質(zhì)體法將siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3以及siRNA-NC轉(zhuǎn)染入QBC939細(xì)胞內(nèi),置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,使用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中VIM的表達(dá)量。

1.4.2細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 將siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3以及siRNA-NC轉(zhuǎn)染入QBC939細(xì)胞24 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔3000細(xì)胞加入6孔板培養(yǎng),6天后顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞菌落形成,棄去培養(yǎng)基用4%多聚甲醛固定30 min,結(jié)晶紫溶液染色30 min,PBS清洗后拍照保存。

1.4.3活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn) 將siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3以及siRNA-NC轉(zhuǎn)染入QBC939細(xì)胞24 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔0.3×105細(xì)胞加入48孔板中,培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后上機(jī)檢測(cè),每間隔40 min進(jìn)行拍照記錄。

1.4.4裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 按照每只0.2 ml且細(xì)胞數(shù)目為2×106的QBC939細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下,用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑(L)和最短徑(W),按照公式V(mm3)=0.52×L×W2計(jì)算瘤體積。待皮下移植瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí),將成瘤的裸鼠隨機(jī)均分為3組給予藥物干預(yù),分別為Control組(每只注射0.2 ml的生理鹽水)、siRNA-VIM組(每只注射0.2 ml的siRNA-VIM2)、siRNA-NC組(每只注射0.2 ml的siRNA-NC)。每天1次,每3天測(cè)量一次腫瘤體積大小。15 d后脫頸處死小鼠,剝?nèi)×鲶w測(cè)量體積。

1.4.6HE染色實(shí)驗(yàn) 取各組瘤體依次進(jìn)行石蠟切片;脫蠟、水化;蒸餾水沖洗;蘇木素染色、流水沖洗;1%鹽酸酒精分化、流水沖洗;氨水返藍(lán)后流水沖洗;伊紅染色;脫水透明;切片晾干后中性樹(shù)膠封閉;顯微鏡下采集圖像分析。

1.4.7免疫組織化學(xué)染色 對(duì)各組瘤體依次進(jìn)行石蠟切片;脫蠟、水化;EDTA修復(fù);雙氧水孵育;BSA封閉;加一抗孵育過(guò)夜;加二抗孵育;DAB顯色后蘇木素復(fù)染;脫水透明后中性樹(shù)膠封閉、顯微鏡下觀察。免疫組化結(jié)果判讀使用Image Pro plus測(cè)量平均IOD值進(jìn)行分析。

1.4.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS26.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示計(jì)量資料,兩組之間比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用方差分析,當(dāng)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)siRNA干擾QBC939細(xì)胞VIM的mRNA表達(dá)情況

將不同組的siRNA-VIM轉(zhuǎn)染入QBC939細(xì)胞48 h后,檢測(cè)各組細(xì)胞VIM的mRNA表達(dá)情況。三組不同的siRNA-VIM轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,其VIM的表達(dá)量均低于siRNA-NC組(P<0.05)。且在三組實(shí)驗(yàn)組中,siRNA-VIM2轉(zhuǎn)染后抑制VIM表達(dá)效果更好,見(jiàn)圖1。

圖1 不同轉(zhuǎn)染組VIM的mRNA表達(dá)情況

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察siRNA-VIM對(duì)QBC939細(xì)胞克隆形成能力的影響

采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制VIM表達(dá)后對(duì)QBC939細(xì)胞克隆形成能力的影響。與對(duì)照組相比,三組核酸序列不同的siRNA去抑制VIM的表達(dá)后,均可以使QBC939細(xì)胞的克隆形成數(shù)呈現(xiàn)出顯著減少的趨勢(shì)(P<0.05),見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞克隆結(jié)果圖

圖3 各組細(xì)胞克隆數(shù)目結(jié)果圖

2.3 活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)siRNA-VIM對(duì)肝門部膽管癌QBC939細(xì)胞分裂能力的影響

使用三維低氧多通道成像儀在40倍鏡明場(chǎng)下對(duì)QBC939細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),從上機(jī)監(jiān)測(cè)開(kāi)始規(guī)定時(shí)間為0 h,每間隔40 min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照,48 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。每組取3個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野中細(xì)胞核數(shù)目,取3個(gè)視野中細(xì)胞核數(shù)目的平均值。與siRNA-NC對(duì)照組相比,siRNA-VIM1、siRNA-VIM2以及siRNA-VIM3組的細(xì)胞分裂數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖4～8,表1。

表1 各組細(xì)胞核數(shù)目

圖4 各組QBC939細(xì)胞分裂0 h圖

圖5 各組QBC939細(xì)胞分裂12 h圖

圖6 各組QBC939細(xì)胞分裂24 h圖

圖8 各組QBC939細(xì)胞分裂48 h圖

2.4 抑制VIM對(duì)肝門部膽管癌QBC939裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用

在QBC939裸鼠移植瘤模型中抑制VIM表達(dá)后,觀察移植瘤生長(zhǎng)體積的變化。與對(duì)照組相比,siRNA-VIM組可以使腫瘤生長(zhǎng)速度受到抑制,見(jiàn)圖9～10,表2。

表2 各組肝門部膽管癌裸鼠皮下移植瘤體積

圖9 肝門部膽管癌荷瘤裸鼠瘤體

圖10 肝門部膽管癌荷瘤裸鼠體積箱式圖

2.5 qRT-PCR檢測(cè)裸鼠瘤組織中VIM的mRNA相對(duì)表達(dá)量

使用qRT-PCR檢測(cè)各組裸鼠瘤組織中VIM的mRNA相對(duì)表達(dá)量,與對(duì)照組相比,裸鼠瘤組織內(nèi)注射siRNA-VIM,其瘤體內(nèi)VIM表達(dá)在mRNA水平上顯著降低,見(jiàn)圖11。

圖11 各組瘤組織mRNA表達(dá)量

2.6 裸鼠瘤組織HE染色結(jié)果

Control組、siRNA-NC組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞大小不一,核大,核仁清晰,可見(jiàn)核分裂像,未見(jiàn)明顯壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。siRNA-VIM組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞減少,排列疏松,細(xì)胞核萎縮,核仁較不清晰,可見(jiàn)片狀壞死,伴輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖12。

圖12 各組瘤體HE染色(×20)

2.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)裸鼠瘤組織中VIM的表達(dá)情況

每組瘤組織共切取3份樣本包埋進(jìn)行免疫組化檢測(cè),siRNA-VIM與Control組和siRNA-NC組相比VIM表達(dá)下降(P<0.05),siRNA-NC組與Control組相比VIM表達(dá)變化無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖13及表3。

表3 免疫組化IOD值

圖13 免疫組化檢測(cè)各組瘤體中VIM表達(dá)情況(×20)

3 討論

手術(shù)是HCCA最好的治療選擇,目標(biāo)是根治邊緣陰性(R0)腫瘤的切除。但切除HCCA的5年疾病特異性生存率約為40%,切除后復(fù)發(fā)很常見(jiàn)[6]。由于缺乏早期癥狀,很高比例的患者在出現(xiàn)時(shí)被診斷為晚期疾病(血管受累;肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移)[7],已經(jīng)失去了手術(shù)的最佳時(shí)期,且由于其早期可能侵犯肝動(dòng)脈和門靜脈,手術(shù)切除非常困難。在現(xiàn)有的治療方法中,HCCA的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高,生存率低。VIM作為一種細(xì)胞骨架和EMT的一種關(guān)鍵標(biāo)志物,與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移以及侵襲能力密切相關(guān)[8]。許多數(shù)據(jù)證實(shí)波形蛋白參與腫瘤細(xì)胞的侵襲,波形蛋白還與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[9]。在體外,波形蛋白被證明是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在集體侵襲期間運(yùn)動(dòng)所必需的,而波形蛋白的敲除抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲[10],而且可以恢復(fù)部分其上皮表型。研究表明上皮衍生腫瘤細(xì)胞中VIM表達(dá)的上調(diào)是EMT誘導(dǎo)的先決條件,也是EMT的主要引發(fā)劑[11]。

本研究首先通過(guò)構(gòu)建可以抑制VIM表達(dá)的不同核苷酸序列的siRNA,成功將siRNA轉(zhuǎn)染到肝門部膽管癌細(xì)胞株QBC939中,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞克隆以及活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)觀察細(xì)胞分裂情況,對(duì)比轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照siRNA-NC和實(shí)驗(yàn)組siRNA-VIM得到抑制QBC939細(xì)胞VIM表達(dá)后,細(xì)胞的克隆能力以及分裂能力均呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。說(shuō)明在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,抑制VIM的表達(dá)后,對(duì)肝門部膽管癌細(xì)胞的克隆及分裂能力具有明顯的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建肝門部膽管癌皮下移植瘤裸鼠模型,在造模成功后,分別對(duì)荷瘤裸鼠瘤體注射生理鹽水、siRNA-VIM、siRNA-NC,2周后測(cè)量各組荷瘤裸鼠瘤體積大小,注射siRNA-VIM組瘤體積小于另外2組,生理鹽水組與siRNA-NC組瘤體積無(wú)顯著差異,說(shuō)明抑制VIM表達(dá)后,裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度減慢。通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)各組肝門部膽管癌荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)的VIM表達(dá),siRNA-VIM組瘤體積中VIM表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,生理鹽水組與siRNA-NC組中VIM表達(dá)無(wú)明顯差異。同時(shí)對(duì)各組瘤體進(jìn)行HE染色,siRNA-VIM組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞減少、排列疏松、細(xì)胞核萎縮、核仁較不清晰、可見(jiàn)片狀壞死、伴輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明VIM可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。用免疫組化驗(yàn)證各組瘤體中VIM表達(dá),siRNA-VIM與生理鹽水和siRNA-NC組相比VIM表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA-NC組與生理鹽水組相比VIM表達(dá)變化無(wú)顯著差異。因此推斷抑制VIM表達(dá)是抑制肝門部膽管癌進(jìn)展的機(jī)制之一,VIM在肝門部膽管癌的進(jìn)展中起一定作用。VIM作為EMT的重要標(biāo)志物,與腫瘤的進(jìn)展有密切聯(lián)系,抑制VIM表達(dá)會(huì)影響EMT誘導(dǎo)的發(fā)生。