高旭,王清冰,陳義兵

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科遺傳與產(chǎn)前診斷中心,河南 鄭州 450000)

無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)主要應(yīng)用于孕期產(chǎn)檢篩查,其基本原理是提取孕婦外周血中的全部游離DNA進行高通量測序,然后和數(shù)據(jù)庫中的人類基因組DNA進行比對。如果胎兒的21號、18號或13號染色體明顯升高,則預(yù)示胎兒有患21-三體、18-三體、13-三體的風險;如果正常,則提示NIPT陰性。由于NIPT僅作為篩查工具,存在假陽性和假陰性,因此不能作為診斷的依據(jù)。本文通過1例13-三體高Z值假陽性病例分析,顯示侵入性產(chǎn)前診斷對于明確診斷仍具有不可替代的價值,即使很高的Z值仍可能為假陽性結(jié)果。

1 病例介紹

孕婦31歲,孕18周,孕次2產(chǎn)1次,無不良孕產(chǎn)史,家族遺傳史陰性,中孕期血清學篩查提示臨界風險,遂到鄭州大學第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心就診。在充分了解無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non- invasive prenatal testing,NIPT)優(yōu)點及風險后,孕婦書面簽署知情并同意行NIPT。采集孕婦10 mL靜脈血,于8 h內(nèi)1 600g4 ℃離心10 min,所得上清液再于16 000g4 ℃條件離心10 min,取上清液于-80 ℃凍存。參考本中心成熟技術(shù)制備樣本DNA,經(jīng)檢測合格后制備DNA文庫并生成測序簇,利用貝瑞和康NextSeq CN500測序平臺行36 bp單端高通量測序,測序深度為0.66倍的高通量測序[1]。將測序所得序列與人類基因組參考序列(hg19)在BWA map軟件上進行比對,所得結(jié)果再利用自有軟件BGPD v2.0.1統(tǒng)計每條染色體序列個數(shù),計算每條染色體占比(%chrN),并得出其Z值,其陽性切值為±3。結(jié)果顯示胎兒13號染色體Z值為19.18,提示患13-三體風險高。孕婦因此再次來院就診咨詢,在充分知情并了解風險后,孕婦簽署知情同意書行侵入性產(chǎn)前診斷,取羊水樣品進行染色體核型和拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)分析。孕婦于孕19周在無菌條件下行羊膜腔穿刺取樣術(shù),所得樣品利用常規(guī)方法制備染色體G顯帶標本,成功后進行鏡下染色體核型分析,按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN-2009)標準描述核型。運用貝瑞和康公司的CNV檢測(CNV sequencing,CNV-seq)試劑盒經(jīng)過提取胎兒細胞基因組DNA和建庫測序并進行后續(xù)生物信息學分析,應(yīng)用DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk/)、DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/)、OMIM(https://www.omim.org/)等在線數(shù)據(jù)庫,結(jié)合本中心的內(nèi)部數(shù)據(jù)對結(jié)果進行解讀[2]。羊水染色體核型分析提示胎兒核型為46,XN,見圖1,未見核型異常。CNV-seq技術(shù)對胎兒羊水細胞DNA 進行分析,結(jié)果提示seq[hg19]46,XN,見圖2,未見基因組拷貝數(shù)異常。

圖1 患者染色體核型結(jié)果

圖2 患者CNV-seq結(jié)果

2 討論

自1997年香港中文大學盧煜明教授在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA并開發(fā)出相應(yīng)技術(shù)用以篩查胎兒染色體非整倍體風險以來[3],NIPT已在我國臨床實踐中廣泛用于篩查胎兒染色體非整倍體風險,其對13-三體、18-三體和21-三體均具有較好的檢測靈敏度和特異度[4]。然而NIPT仍然只是篩查性檢測,其結(jié)果可能與產(chǎn)前診斷結(jié)果不符[5]。NIPT提示非整倍體或其他異常核型為高風險(結(jié)果陽性),但侵入性產(chǎn)前診斷報告胎兒染色體正常的情況稱為NIPT假陽性。與假陰性結(jié)果相比,假陽性結(jié)果更為常見,而孕婦對陽性結(jié)果往往又非常焦慮。NIPT假陽性發(fā)生的原因有多種,主要包括孕婦本人染色體異常、限制性胎盤嵌合、DNA拷貝數(shù)異常、雙胎、胎兒游離DNA水平過低以及孕婦腫瘤等因素。NIPT雖能夠準確檢測孕婦外周血游離DNA總濃度的變化,但對其變化來源卻無法分辨。NIPT陽性病例往往具有較高的胎兒染色體異常檢出率,但仍存在假陽性可能。孕婦外周血游離DNA大部分來源于母體,雖然其分離與純化技術(shù)日益成熟且嚴格,但樣本中仍會存在部分影響胎兒游離DNA檢測的片段,這就可能會導(dǎo)致NIPT假陽性。胎盤的組織基因組大部分情況下與胎兒相同,而孕婦外周血游離胎兒DNA主要來源于胎盤滋養(yǎng)層細胞,因此理論上檢測孕婦外周血胎兒游離DNA即可獲得與胎兒組織相同的檢測結(jié)果。然而,胎盤細胞有絲分裂過程中可能出現(xiàn)染色體不分離或重排,導(dǎo)致部分胎盤組織染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常,這些染色體異常的細胞可與正常核型胎盤細胞嵌合在一起,造成胎盤限制性嵌合,其中異常染色體細胞釋放的游離DNA可在NIPT中檢測到,導(dǎo)致NIPT呈假陽性結(jié)果,但此時胎兒染色體依舊正常。雙胎妊娠時,若其中一胎早期停育,死亡胎兒或胚胎細胞將發(fā)生凋亡并釋放大量cfDNA到孕婦外周血中,在超聲檢查看不到死亡胎兒或胚胎的情況下仍可能有其cfDNA釋放,導(dǎo)致NIPT篩查呈假陽性[6]。其他情況如染色體倒位、平衡易位等情況也可導(dǎo)致NIPT假陽性或假陰性,NIPT對這些染色體異常不敏感。另外,檢測流程、分析算法和技術(shù)平臺類型都可能影響陽性預(yù)測值和假陽性率。據(jù)統(tǒng)計,67%的NIPT假陽性病例無法明確原因[7]。國內(nèi)一項146 958例NIPT研究統(tǒng)計顯示,在23例13-三體假陽性中,3例有孕婦CNV正常變異(2例最終確診),9例懷疑限制性胎盤嵌合(2例在產(chǎn)后胎盤中得到驗證),另外12例無法明確原因[8]。因此,NIPT雖然是一種較好的染色體風險篩查技術(shù),但不能取代傳統(tǒng)的侵入性染色體產(chǎn)前診斷方法。通過羊膜腔穿刺術(shù)來檢測孕婦的核型及微陣列檢測來進行確診仍具有重要價值。

13號染色體GC含量(鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率)較低會導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)偏倚,更易出現(xiàn)假陽性,致其陽性預(yù)測值較低[8]。13-三體的胚胎或胎兒往往在妊娠早期即發(fā)生宮內(nèi)死亡,這使得只有少數(shù)胎兒存活至中孕期篩查階段[9]。另外13-三體發(fā)生率只有1/10 000,在大樣本臨床數(shù)據(jù)中也只有零星病例,致使所統(tǒng)計的陽性預(yù)測值和假陽性率也產(chǎn)生統(tǒng)計學偏倚,不同醫(yī)療機構(gòu)所統(tǒng)計陽性預(yù)測值存在較大差異。就目前世界范圍內(nèi)NIPT臨床實踐來看,NIPT對13-三體篩查的陽性預(yù)測值普遍偏低,假陽性率普遍偏高。國內(nèi)北京大學深圳醫(yī)院分析了545例NIPT高風險孕婦數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)13-三體的陽性預(yù)測值為22%(9/41)[10],江西省婦幼保健院36 913名孕婦無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果顯示13-三體的陽性預(yù)測值為41.94%(13/31)[11],吉林大學第一醫(yī)院17 428例NIPT數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果中13-三體的陽性預(yù)測值為33.33%(1/3)[12],寧波市婦幼保健院42 910例NIPT數(shù)據(jù)顯示13-三體陽性預(yù)測值僅為13.79%(4/33)[13],常州市婦幼保健院57 204例NIPT數(shù)據(jù)顯示13-三體的陽性預(yù)測值為18%～25%[14],南方醫(yī)院統(tǒng)計41 819例NIPT發(fā)現(xiàn)13-三體陽性預(yù)測值為40%(6/15)[15],國內(nèi)另一項統(tǒng)計146 958例NIPT數(shù)據(jù)顯示13-三體陽性預(yù)測值為32.84%(22/45)[7],日本醫(yī)科大學附屬醫(yī)院8 a 764例NIPT篩查中13-三體陽性預(yù)測值為50%(1/2)[16]。然而在國外一些早期NIPT研究中,可以看到13-三體的陽性預(yù)測值普遍高于60%,這可能與這些臨床研究的都是高風險孕婦有關(guān)[17],日本55家醫(yī)療機構(gòu)30 613例NIPT數(shù)據(jù)整合統(tǒng)計的13-三體陽性預(yù)測值為63.6%(28/50)[18]。Iwarsson等[19]的系統(tǒng)評價和meta分析研究表明,NIPT在普通孕婦群體中篩查21-三體的陽性預(yù)測值是80.8%(156/193),在高危孕婦中21-三體的陽性預(yù)測值是97.3%(1 839/1 891),足足提高了30倍。該研究還提示,NIPT在高危孕婦中13三體的陽性預(yù)測值是70.5%(134/190),但是該研究缺乏普通孕婦13-三體陽性預(yù)測值,但可以預(yù)見其在普通孕婦中陽性預(yù)測值會顯著下降。Verweij等[17]指出NIPT篩查的陽性預(yù)測值依賴于其發(fā)病率,由于普通人群中13-三體發(fā)生率極低,對普通孕婦應(yīng)用NIPT篩查13-三體時需要慎重。至于NIPT篩查Z值與陽性預(yù)測值的關(guān)系,目前研究尚無確定的結(jié)論。國內(nèi)廖燦團隊在214例NIPT高風險孕婦中分析了Z值與13、18、21三種染色體三體的相關(guān)性,logistic回歸模型顯示Z值與21、18-三體顯著相關(guān),但是與13-三體的相關(guān)性并不顯著,ROC曲線分析也顯示Z值預(yù)測對13-三體的預(yù)測效能不如21、18-三體,其中2例正常核型胎兒Z值大于20,其陽性預(yù)測值僅為28%(7/25),其中高Z值亞組的陽性預(yù)測值也只有46.15%[20]。遵義市婦幼保健院團隊也分析了24 384例NIPT中假陽性情況,其中共有假陽性103例,13-三體假陽性15例[21]。本研究分析了Z值預(yù)測假陽性情況,發(fā)現(xiàn)Z值介于3～13時,陽性預(yù)測值只有14.3%(1/7),而當Z>13時,陽性預(yù)測值可達100%?？梢?由于13-三體過低的發(fā)生率,NIPT篩查陽性和實際陽性病例均太少,缺乏足夠的病例數(shù)量建立預(yù)統(tǒng)計效能良好的測體系,目前通過Z值大小并不能準確預(yù)測胎兒陽性情況。

3 結(jié)論

對于無創(chuàng)DNA篩查出現(xiàn)的13-三體高風險病例,侵入性產(chǎn)前診斷對于明確診斷仍具有不可替代的價值,即使很高的Z值仍可能為假陽性結(jié)果,充分告知孕婦相關(guān)知識也有利于緩解其焦慮情緒,改善診療依從性。