生長板損傷后骨橋形成分子機制的研究進展

任廷果,彭國璇,孫 紅,林廉洋,彭洪成,黃明智,姜 華,鄧 進,

1.貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院,貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診醫(yī)學科,貴陽 550004; 3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科,貴陽 550004; 4.貴州省骨科醫(yī)院小兒骨科,貴陽 550007; 5.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院小兒外科,貴陽 550004

生長板,也稱骺板,是位于骨骺和骨干之間的薄層波浪樣軟骨,組成生長板的軟骨細胞持續(xù)動態(tài)發(fā)育維持機體骨骼縱向生長[1]。軟骨內(nèi)成骨(endochondral ossification,EO),又稱“軟骨內(nèi)化骨”或“軟骨內(nèi)骨化”,是脊椎動物骨骼正常發(fā)育及修復過程中最基本、最重要的方式,控制著軟骨細胞增殖、分化、凋亡以及最終礦化的生命歷程[2]。軟骨細胞經(jīng)過增殖、肥大和凋亡構(gòu)建軟骨細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),ECM被血管、破骨細胞、骨髓細胞和成骨細胞侵入進而沉積、礦化發(fā)育成骨。ECM在軟骨發(fā)育和EO過程中的骨骼框架的建立中起重要作用,也為細胞-基質(zhì)相互作用提供空間背景,特定的化學和機械信號在ECM內(nèi)傳遞,影響細胞基質(zhì)合成、遷移、增殖、存活和分化,從而對軟骨內(nèi)成骨產(chǎn)生影響[3]。軟骨細胞的增殖、分化、成熟、礦化也受到多種因子的調(diào)控,如轉(zhuǎn)化因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長因子、成纖維生長因子及其受體(fibroblast growth factor/FGF receptor,FGF/FGFR)、印度刺猬因子(Indian hedgehog,Ihh)等[4]。

生長板損傷是涉及骨骼縱向生長機制損傷的總稱,包括生長板、Ranvier區(qū)與干骺端損傷[5]。生長板位于骨骺與干骺端之間,分為靜止區(qū)、增殖區(qū)、肥大區(qū)和鈣化區(qū),各區(qū)域軟骨細胞形態(tài)功能不一。隨著生長板軟骨細胞分裂與增殖,骨骺側(cè)向著骨干側(cè)不斷進行程序化軟骨內(nèi)成骨,間質(zhì)鈣化以及軟骨細胞的壞死、分解后最終鈣化成骨。Ranvier區(qū)是存在于骨骺板周圍的一個環(huán)形軟骨膜骨化溝,在臨床上,累及Ranvier區(qū)的損傷?？蓪е瞒堪宓陌l(fā)育紊亂,也可導致外骨橋的形成以及骨腫瘤的發(fā)生[6]。軟骨細胞損傷后會釋放一些與成骨相關(guān)的細胞因子導致?lián)p傷區(qū)域軟骨細胞礦化,還可以破壞生長板生長區(qū)軟骨或血供導致生長板失去正常生理功能提前閉合,致使局部軟骨礦化形成骨橋[7]。因此,明確生長板損傷后生長板軟骨細胞礦化的具體調(diào)控機制,將有助于尋找抑制生長板損傷后骨橋形成的新思路,進而有效控制或延緩生長板損傷骨橋形成或骨骼畸形的發(fā)生和發(fā)展。

1 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)

VEGF是由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盤生長因子6個家族成員組成的同源二聚體蛋白[8]。在骨骺生長板中,VEGF主要表達于肥大層軟骨細胞,較少表達于靜息或增殖層軟骨細胞[9]。研究表明,大生長板軟骨細胞分泌VEGF招募單個內(nèi)皮細胞和促進現(xiàn)有血管生成,而生長板周圍區(qū)域未分化的多能祖細胞在VEGF刺激下促進血管系統(tǒng)侵入,從而啟動二級骨化中心形成,是骨骼生理性血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子[10]。Gerber等[9]研究發(fā)現(xiàn)VEGF通過介導毛細血管侵襲進而調(diào)節(jié)生長板形態(tài)發(fā)生和觸發(fā)軟骨重塑,而抑制VEGF會阻礙毛細血管生成,導致骨小梁形成受損、肥大軟骨區(qū)擴張和生長板結(jié)構(gòu)紊亂。Ma等[11]也證實了敲除晝夜節(jié)律核心基因Bmal1骨細胞中VEGF和低氧誘導因子1α亞單位(hypoxia inducible factor 1alpha,HIF1α)表達下降,生長板軟骨細胞中VEGF和HIF1α表達下調(diào),會提高基質(zhì)蛋白酶13(matrix metalloproteinases13,MMP13)和Runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的水平,促進生長板軟骨細胞礦化。此外,Gruber等[12]通過骨骺鉆孔損傷動物模型證實,隨著骨橋形成越多,生長板靜止區(qū)和增殖區(qū)血管床VEGF表達越多,推測VEGF可能對于骨骺骨折后骺板阻滯的預防和治療有指導意義。Erickson等[13]也發(fā)現(xiàn)抗VEGF抗體可以抑制生長板損傷骨橋形成且不影響骨骼正常生長,VEGF和FGF家族激酶受體非靶向抗血管抑制劑酪氨酸激酶抑制劑也能有效緩解骨骺生長板發(fā)育不良,初步說明抑制VEGF可能成為生長板相關(guān)疾病的治療靶點,對生長板損傷的治療也不例外。

隨著對VEGF在生長板軟骨下成骨過程生理機制的不斷深入,越來越多圍繞VEGF開發(fā)的藥物逐漸應用,這可能為生長板損傷骨橋形成的治療提供新方式。

2 Ihh

20世紀80年代初,德國女遺傳學家C.Nusslein-Volhard和美國遺傳學家E.Wieschaus使用果蠅飽和突變的方法發(fā)現(xiàn)刺猬基因突變使得果蠅幼蟲身體無毛部分變成有毛,故命名為“刺猬”基因[14]。此后,科學家們還發(fā)現(xiàn)與Hh基因同源、功能各不相同的音速刺猬因子、沙漠刺猬因子和Ihh。Ihh是一種由胚胎發(fā)育期間的扁平狀肥大前軟骨細胞所表達的大分泌型蛋白,通過作用于12次跨膜蛋白受體Patched(Ptch1和Ptch2)和7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體Smoothened(Smo),進而釋放Smo蛋白靶向下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白發(fā)揮生物學效應[15]。研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)細胞特異性Ihh缺失小鼠胚胎期生長板軟骨支架骨化明顯,導致生長板和指骨關(guān)節(jié)的發(fā)育障礙,出生后立即出現(xiàn)短肢和侏儒表型[16]。而遺傳學研究也表明, Ihh介導的Hh信號的激活通過調(diào)節(jié)軟骨細胞分化、增殖以及成骨細胞形成3個方面控制EO過程[17]。而Ihh基因中p.E95K、p.D100E以及p.E131K發(fā)生點突變通過損害受體Ptch1和Gli1靶點活性,進而抑制軟骨下成骨,導致小鼠遠端足趾形成障礙[18]。有研究證實,Hh信號通過其氨基末端結(jié)構(gòu)域(Hh-N)介導,Hh-N作為多價脂蛋白顆粒被雙重脂化和分泌,Hh-N信號接收是由應答細胞上Patched、Smo、Ihog和脊椎動物特異性蛋白Hip、Gas1的幾種細胞表面蛋白共同調(diào)節(jié)[19]。有研究證實堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子Hand1通過抑制Ihh近端啟動子Runx2的反式激活,下調(diào)Ihh基因的表達控制EO過程,且Hand1和Hand2基因的過度表達導致了骨干的產(chǎn)前發(fā)育不良或再生骨化[20]。以上說明Ihh的正常表達對于維持生長板、關(guān)節(jié)軟骨以及初級松質(zhì)骨的發(fā)育均不可或缺。此外,Vasques等[21]發(fā)現(xiàn)使用重組生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH)有效治療Ihh突變引起的短肢畸形。Yoshida等[22]提出Ihh的表達受到PTHrP的抑制,因為PTH受體與Ihh在肥大前軟骨細胞中特異性表達是一致的。筆者研究也證實rhGH通過Ihh-PTHrP信號通路延緩糖皮質(zhì)激素所致生長板軟骨細胞凋亡,促進了激素所致長骨生長畸形的恢復[23]。眾所周知,Ihh-PTHrP信號通路被認為是軟骨細胞肥大的一個負反饋環(huán)路,而轉(zhuǎn)錄因子Sox9以及與Gli2結(jié)合的Foxc1均調(diào)節(jié)PTHrP的表達[24]。Hattori等[25]通過在肥大的軟骨細胞中錯誤表達Sox9,導致VEGF的表達降低,并抑制血管對軟骨和軟骨骨化的侵襲,表明Sox9是軟骨血管化、骨髓形成和軟骨內(nèi)成骨的主要負調(diào)控因子。而Foxc1已經(jīng)被確定為軟骨中高表達的轉(zhuǎn)錄因子,并且也參與了Col10a1分泌調(diào)節(jié)[26]。因此,Sox9和Gli2結(jié)合的Foxc1信號的合作誘導PTHrP可以防止軟骨細胞的肥大,Sox9抑制軟骨血管化、骨髓形成和軟骨內(nèi)成骨。此外,PTHrP和組蛋白去乙?；?(Histone deacetylase 4,HDAC4)也共同參與調(diào)節(jié)軟骨細胞肥大的途徑。激活PTHrP/cAMP/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號通路使PKA靶點磷酸化,從而增加了細胞核中HDAC4的含量,HDAC4同時與肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2,Mef2)、Runx2結(jié)合,抑制軟骨細胞肥大[27]。

綜上所述,Ihh-PTHrP負反饋環(huán)路調(diào)控EO進程進而影響骨骼發(fā)育障礙,Ihh基因可能作為生長板損傷治療的重要靶點,但仍需進一步證實。

3 FGFR3

FGFR3廣泛分布于血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、T及B淋巴細胞表面,是一種由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3部分組成的跨膜受體[28]。FGFR3功能異常時常導致軟骨發(fā)育不全等多種軟骨發(fā)育性疾病。既往有大量研究證實,FGFR3跨膜結(jié)構(gòu)域功能位點突變會改變生長板軟骨細胞終末分化潛能,導致軟骨發(fā)育不全,從而減緩生長板EO過程[29]。值得注意的是,FGFR3基因ser365Cys突變通過改變Ihh-PTHrP信號通路促使Ihh、PTHrP表達下調(diào),抑制長骨骨骼生長[30-31]。研究發(fā)現(xiàn),在條件性敲除FGFR3的斑馬魚中Wnt/β-catenin信號表達增強,而抑制Wnt/β-catenin信號通路可部分緩解FGFR3突變造成的骨骼畸形表型[32]。Zheng等[33]研究發(fā)現(xiàn),當sLC26A2基因敲除后,可能激活了活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF-6),進而觸發(fā)蛋白折疊導致FCFR3信號過度激活,致使小鼠軟骨發(fā)育異常,而抑制FCFR3及其下游效應基因的磷酸化后骨骼畸形情況得到改善。Chen等[34]為了探討成骨的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子FGFR3是否也影響穩(wěn)定骨折的再生,意外發(fā)現(xiàn)FGFR3的功能獲得性突變抑制了軟骨形成的始動階段和隨后的骨形成。Balek等[35]使用AR0087(一種新型FGFR抑制劑)阻斷FGFR3活性發(fā)現(xiàn),軟骨細胞增殖得到改善,軟骨細胞的衰老以及ECM丟失明顯減緩,表明AR0087可恢復正常的生長板結(jié)構(gòu)并消除FGFR3對軟骨細胞肥大分化的影響。此外,FGFR抑制劑AR0087還能明顯抑制FGFR1、FGFR2突變體活性,防止生長板軟骨過度分化。

大量研究已經(jīng)證實FGFR3在生長板發(fā)育、軟骨內(nèi)成骨過程中扮演重要作用,FGFR3如何參與生長板損傷骨橋形成,仍需進一步研究。隨著研究的深入,FGFR3應該可以作為生長板損傷治療的重要靶點。

4 縫隙引導配體3(slit guidance ligand 3,SLIT3)

SLIT家族是一類通過與(roundabout,ROBO)受體相互作用在多種生理和病理活動中發(fā)揮重要作用的分泌性蛋白家族,首次在果蠅胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),在許多物種中高度保守,迄今為止在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)并鑒定出了3個家族成員(SLIT1、SLIT2、SLIT3)[36]。SLIT1在骨組織中的表達量最低,而SLIT2和SLIT3在成骨細胞和破骨細胞中均有表達,但其表達水平可能因細胞的狀態(tài)而不同[37]。在哺乳動物中有4種ROBO受體(ROBO1-4), ROBO1和ROBO3在破骨細胞中表達,ROBO1和ROBO2在成骨細胞中表達,而ROBO4在成骨細胞中幾乎不表達,值得注意的是,ROBO1、ROBO2和ROBO4在所有類型的血管內(nèi)皮細胞中均有表達[37- 38]。Kim等[39]使用了分級分泌組學方法,發(fā)現(xiàn)SLIT3可以通過激活β-catenin刺激成骨細胞遷移和增殖,SLIT3還通過以自分泌的方式抑制破骨細胞的分化來抑制骨吸收,并表明SLIT3是代謝性骨病的潛在治療靶點。Kim等[40]進一步實驗發(fā)現(xiàn)SLIT3刺激了軟骨細胞分化標志物COL2A1、Sox9、COL10A1、VEGF和MMP13在細胞中的表達以及抑制了細胞中的β-catenin活性,表明SLIT3/ROBO2通過抑制β-catenin信號通路促進軟骨細胞成熟,但并不調(diào)控軟骨細胞數(shù)量的增殖。SLIT3是一個由成骨細胞衍生的促血管生成因子,而血管也可以通過分泌信號分子來調(diào)節(jié)骨形成,血管生成與骨形成在時間和空間上的這種密切聯(lián)系被稱為“血管生成-成骨耦合”[41]。CD31hiEMCNhi型血管是一種在血管內(nèi)皮細胞上高表達CD31和EMCN的血管亞型,其位于干骺端,周圍有致密的骨祖細胞,可以通過產(chǎn)生刺激骨祖細胞增殖與分化的因子引導骨的形成[42]。SLIT3的遺傳性缺失會減少骨骼CD31hiEMCNhi型血管內(nèi)皮細胞,導致骨形成受損而產(chǎn)生低骨量,部分逆轉(zhuǎn)Shn3-/-小鼠的高骨量表型,而成骨細胞和CD31hiEMCNhi血管內(nèi)皮細胞之間的這種耦合對骨愈合至關(guān)重要[43]。

綜上所述,在軟骨細胞中SLIT3/ROBO2可以通過抑制β-catenin信號通路促進軟骨細胞成熟。而在干骺端中,SLIT3可以促進CD31hiEMCNhi型血管的生成,從而引導骨形成。因此,SLIT3可能會為生長板損傷后骨橋的形成治療和預防提供治療靶點。

5 其他炎癥相關(guān)調(diào)控因子

生長板損傷后,炎癥反應常常破壞軟骨細胞的合成代謝和分解代謝平衡。有文獻指出,在大鼠生長板損傷模型中的損傷反應有4個不同階段——分別在第1～3、3～7、7～14、10～25天發(fā)生的炎癥、纖維化、成骨和骨橋成熟重構(gòu)反應[44]。

生長板損傷后的炎癥期階段,中性粒細胞、巨噬細胞/單核細胞和淋巴細胞等炎癥細胞流入生長板損傷部位,并分泌大量細胞因子調(diào)節(jié)下游事件,導致生長板損傷部位的骨橋形成。如白細胞介素-1β( interleukin-1beta,IL-1β)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) 和 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等迅速上調(diào)會導致MMP1和MMP13過表達,導致生長板軟骨損傷后的軟骨細胞、ECM細胞凋亡[45]。Zhou 等[46]證實了IL-1β、TNF-α、TGF-β1 和IGF-I 的表達可能在早期急性炎癥事件以及期骨橋的形成和重塑中發(fā)揮作用。此外,有研究證實環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)對骨折部位初始炎癥反應的下游過程至關(guān)重要,COX-2表達后蛋白多糖(proteoglycan,PG)水平的增加并上調(diào)了各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,這些介質(zhì)與PG增加炎癥反應,促進損傷愈合;而直接抑制COX-導致骨形成和骨折愈合的延遲,這說明損傷誘導的炎癥反應和COX-2酶在組織修復過程中的重要性[47]。生長板損傷誘導關(guān)鍵炎癥介質(zhì)COX-2和iNOS在生長板損傷的炎癥階段顯著上調(diào),表明生長板損傷刺激大量COX-2、iNOS釋放,進而促使骨橋在損傷生長板間隙的形成[48]。

研究表明,在生長板損傷后的纖維化階段,損傷生長板中生長因子FGF-2的mRNA水平顯著上調(diào)[46]。而FGF-2不僅能抑制軟骨細胞分化、增強堿性磷酸酶活性以及刺激骨體外吸收,還能夠通過抑制來自IGF-I 和 TGF-β的關(guān)鍵信號傳導來增加間充質(zhì)細胞的成骨和軟骨分化潛能[49]。也有研究發(fā)現(xiàn),在纖維化階段抑制血小板源生長因子受體信號傳導可降低損傷后第 4 天間充質(zhì)細胞的增殖和浸潤水平,并且在生長板損傷后第14天,損傷部位的骨或軟骨組織的數(shù)量也減少[50]。

纖維化期之后,在骨橋的重塑和成熟過程中,骨小梁被骨髓細胞分隔,在靜息期被扁平的紡錘狀非活性成骨細胞包圍,標志著非活性骨形成[44]。研究表明,在生長板損傷部位新生的骨小梁的某些區(qū)域可見破骨細胞,且損傷生長板上TNF-α、IGF-I和BMP-7的上調(diào)[41]。TNF-α已被證明通過促進骨吸收細胞、破骨細胞的分化,在調(diào)節(jié)骨重塑中發(fā)揮重要作用,而一些細胞因子如IL-1β、TGFβ1也能增強TNFα誘導破骨細胞分化,但需要進一步研究調(diào)控生長板損傷部位骨橋成熟和重塑的分子及細胞機制[51]。

綜上所述,闡明生長板損傷炎癥反應的具體機制,將有助于明確炎癥反應如何參與生長板損傷后生長板軟骨細胞的肥大礦化以及如何維持生長板軟骨細胞功能代謝,這將為生長板損傷提供新思路。

6 總結(jié)與展望

生長板損傷是由創(chuàng)傷、感染、藥物、腫瘤等引起的長骨干骺端軟骨損傷,是兒童及青少年常見的骨骼系統(tǒng)損傷類型之一,損傷常導致肢體短縮與后遺畸形。生長板損傷后骨橋形成所導致的畸形的治療是小兒骨科醫(yī)師亟待解決的熱點問題。隨著不斷深入對生長板軟骨內(nèi)成骨、損傷炎癥反應、損傷后血管的侵入以及損傷后生長板軟骨細胞肥大分化等具體分子機制的研究發(fā)現(xiàn),促進損傷生長板再生成為具備正確極性層次和發(fā)育能力的生長板軟骨組織,并在此基礎(chǔ)上抑制軟骨細胞進一步快速分化為骨橋連接是恢復損傷生長板正常結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵。因此,明確生長板損傷早期骨橋形成的具體機制,將為早期預防骨橋形成和生長板損傷的臨床治療提供新的策略。

作者貢獻聲明：任廷果:文獻檢索及整理、論文撰寫及修改;彭國璇:研究指導、論文修改、經(jīng)費支持;孫紅:研究指導;林廉洋、彭洪成:文獻檢索;黃明智、姜華:研究指導;鄧進:研究指導、論文修改及審校、經(jīng)費支持