微量元素組配對(duì)羊肚菌菌絲發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響

劉柱杉，孫浩翔，溫嘉偉，楊大海，譚笑，夏蕾，張維東

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源與生態(tài)研究所，吉林 長(zhǎng)春 133033)

羊肚菌(Morchella esculenta(L.) Pers.)屬于子囊菌亞門(mén)(Aseomycotina)盤(pán)菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)中最著名的食用蕈菌，因其菌蓋表面有不規(guī)則交叉皺褶網(wǎng)格似羊肚而得名[1]。 羊肚菌富含多種人體必需氨基酸，味道鮮美，因此廣受美食者追捧；同時(shí)，羊肚菌也是重要的藥用菌，不僅含有多糖、脂肪酸、維生素等，也是γ-型藥效氨基酸的重要來(lái)源之一[2]，具有提高機(jī)體免疫力、抗癌癥、抗病毒及降血脂等多種功效[3]。 目前羊肚菌的來(lái)源包括野生采摘和人工栽培，然而隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，使得野生羊肚菌越來(lái)越稀少，現(xiàn)今供應(yīng)市場(chǎng)的羊肚菌主要為人工商業(yè)化栽培[1]。 有研究表明，相比于野生菌，人工栽培的羊肚菌營(yíng)養(yǎng)成分、活性物質(zhì)含量及口感均欠佳，這意味著羊肚菌的人工栽培技術(shù)仍存在許多問(wèn)題，亟待探索解決[4]。

目前，關(guān)于羊肚菌的研究主要集中于人工栽培、培養(yǎng)基配方、發(fā)酵技術(shù)、菌核形成、多糖提取、抗氧化機(jī)制等方面[5]。 在人工栽培中，研究主要涉及培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)羊肚菌品質(zhì)及產(chǎn)量的影響:如沈彤等[6]的研究表明，以生土、羊糞和菌糠組合施用可顯著提高羊肚菌菌柄直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑和單菇羊肚菌重量，子實(shí)體水分、粗纖維、必需氨基酸和呈味氨基酸含量較高，粗多糖、粗脂肪含量較低；宋崴等[7]研究發(fā)現(xiàn)，以草炭、香菇菌糠和有機(jī)肥組培作為培菌基質(zhì)材料，土壤微生物數(shù)量(細(xì)菌、真菌、放線菌)、土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性發(fā)生顯著變化，其中以香菇菌糠和有機(jī)肥組配栽培的羊肚菌鈣、鉀、鎂含量最高。

有研究表明，礦物質(zhì)養(yǎng)分在羊肚菌菌絲發(fā)育及品質(zhì)形成等過(guò)程中亦起著重要作用[8]。 肉斯塔木·艾買(mǎi)提等[9]研究表明，培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)袋基質(zhì)中的氮、碳氮比可顯著影響羊肚菌的出菇時(shí)間、出菇質(zhì)量及產(chǎn)量。 王月等[10]研究發(fā)現(xiàn)，最適宜羊肚菌發(fā)育的碳源為蔗糖、葡萄糖和甘油，最佳氮源為硝酸鉀，對(duì)氨基酸和銨鹽的利用效果較差。 Ayaz等[11]研究表明，土壤中的大量元素N、K 和微量元素Fe、Mo 是影響野生羊肚菌種群密度和揮發(fā)性物質(zhì)成分的重要因子。 上述研究為羊肚菌人工栽培中的施肥提供了一定的理論依據(jù)，但主要集中于碳、氮源等大量元素，對(duì)微量元素的作用鮮有涉及。 基于此，本試驗(yàn)研究Zn、Mn、Fe 及其組配對(duì)羊肚菌菌絲體發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響，以期為羊肚菌的田間微肥施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021 年11 月—2022 年3 月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。 供試羊肚菌物種為梯棱羊肚菌(Morchella septimelata)，采用PDA培養(yǎng)基接種M.septimelata純培養(yǎng)物，然后在PDA培養(yǎng)基上于16 ～18℃超凈臺(tái)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)14 d，之后轉(zhuǎn)移到聚乙烯包裹菌種培養(yǎng)袋(300 g，70%麥麩、15%鋸末、10%谷殼、1%蛭石和4%純土)中，于16～18℃、75%濕度環(huán)境中培養(yǎng)15 d。

供試微肥分別為硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、硫酸錳(MnSO4·4H2O)、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。 試驗(yàn)地土壤類(lèi)型為暗棕壤，耕層土壤理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)含量38.59 g/kg、全氮2.09 g/kg、堿解氮116.27 g/kg、速效磷24.38 mg/kg、速效鉀152.71 mg/kg，土壤含水量23%，pH 值6.56。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共設(shè)置8 個(gè)處理，以不施微肥為對(duì)照(CK)。 其中，單元素處理分別為Zn、Fe、Mn；相應(yīng)的組配處理分別為Zn ＋Fe、Fe ＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn。 其中單元素處理為化合物純量6 g/m2，雙元素處理為各純量3 g/m2，三元素組配處理為各純量2 g/m2。 每處理重復(fù)3次。 小區(qū)面積12 m2(長(zhǎng)4 m，寬3 m)，小區(qū)間以50 cm 寬深溝間隔。

2021 年11 月9 日菌種播前于土表撒施尿素(N 90 kg/hm2)，0～20 cm 土層用旋耕機(jī)細(xì)耕，于試驗(yàn)田離地2 m 正上方搭建遮陽(yáng)網(wǎng)。 將含有大量菌核的菌種培養(yǎng)基質(zhì)(300 g/m2)均勻撒施于土表，并覆一層細(xì)土(3 ～5 cm)，噴灑細(xì)水霧濕潤(rùn)表層以保證菌絲發(fā)育。 菌種播后20 d 將相應(yīng)處理微肥溶于5 L 水中采用隔離式噴施，第二次噴施微肥于播種后60 d 進(jìn)行，CK 噴清水。 期間不定時(shí)適量補(bǔ)給水分，其他管理措施同常規(guī)羊肚菌栽培。 試驗(yàn)周期133 d。

1.3 樣品采集及測(cè)定分析

1.3.1 羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)測(cè)定 根據(jù)Liu 等[12]所述方法采用無(wú)菌水配制成6 mol/L 的相應(yīng)微量元素化合物。 從傳代培養(yǎng)基中挑取一環(huán)(6 mm)菌絲體于另一PDA 培養(yǎng)基中，按照相應(yīng)處理每天加入1 mL 微量元素化合物溶液，且每天下午使用變焦立體顯微鏡(NSW-20P-260， Carton， Japan)觀察菌核顏色和菌絲發(fā)育情況，并采用微卡尺隨機(jī)測(cè)量菌絲體的延伸情況。 菌絲體日生長(zhǎng)速率計(jì)算公式:菌絲體生長(zhǎng)速率(mm/d)＝(菌落直徑-6)/(2×培養(yǎng)天數(shù))[13]，本研究中菌絲生長(zhǎng)測(cè)定時(shí)間為7 d。

1.3.2 羊肚菌氨基酸成分含量測(cè)定 成熟期采收羊肚菌子實(shí)體(菌蓋和菌柄)，并用去離子水小心、仔細(xì)清洗。 將子實(shí)體在55℃烘箱中烘干至恒重并粉碎處理，相關(guān)氨基酸組成及其含量測(cè)定參考熊丙全等[14]的方法略有修改。

準(zhǔn)確稱(chēng)取約100 mg 樣品于水解管中，加入6 mol/L 分析純鹽酸4 mL，采用氮吹儀吹入純氮?dú)?5 min 后封管。 將封口的水解管置于110℃保溫箱中水解24 h，之后取出冷卻至室溫開(kāi)管，采用去離子水定容至50 mL。 準(zhǔn)確吸取1 mL 定容液，采用氮吹儀二次吹氮，在60℃條件下吹脫至干燥。加入0.02 mol/L HCl 溶液2 mL，采用液漩渦器充分混勻，過(guò)0.26 μm 有機(jī)膜小柱，終液采用全自動(dòng)高速氨基酸分析儀(L-8900， Hitachi， Japan)測(cè)定。

1.3.3 羊肚菌產(chǎn)量與相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定羊肚菌多糖含量參照NY/T 1676—2008 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，粗纖維參照GB/Y 5009.10—2003 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，粗脂肪參照GB/Y 5009.6—2016 標(biāo)準(zhǔn)采用酸水解法測(cè)定，粗蛋白參照GB/Y 5009.5—2016 標(biāo)準(zhǔn)采用凱氏定氮法測(cè)定。 產(chǎn)量以小區(qū)子實(shí)體收獲的干物質(zhì)重?fù)Q算而成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯氏多重比較法(α ＝0.05)，采用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌菌絲體發(fā)育和菌核形成的影響

由表1 看出，不同微量元素處理均可提高羊肚菌菌絲體的生長(zhǎng)速率，其中含Mn 各處理表現(xiàn)較好，Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn 處理較CK分別顯著增加21.83%、23.81%、19.77%、21.29%，且各處理的菌絲活力均較強(qiáng)。 單施Mn 處理，菌株最早形成菌核(第9 天)，CK 和Zn＋Mn 處理菌核形成較晚，分別為第16 天和第15 天，各處理菌核出現(xiàn)時(shí)間由早到晚的順序?yàn)镸n＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＞Zn＋Mn＞CK。 此外，在菌核顏色中，所有微量元素組配處理的菌核顏色較單施處理更深。

表1 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)和菌核形成的影響

2.2 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌菌絲體和菌核形態(tài)的影響

由圖1 看出，在羊肚菌菌株發(fā)育過(guò)程中，菌核首先在復(fù)雜交錯(cuò)的菌絲網(wǎng)中形成，隨后慢慢壯大；菌核最初是白色的，成熟后顏色由淡黃色變?yōu)樽厣?圖1A～D)，在菌核(以白色棉花球的形狀存在)覆蓋培養(yǎng)基表面之前，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌絲體短而密集(圖1E)、疏而直立(圖1F)、密集而叢生(圖1G)，最后菌絲完全覆蓋于培養(yǎng)基表面，在立體顯微鏡下還觀察到菌核表面有許多短的垂直菌絲體(圖1H)。 在變焦立體顯微鏡下觀察到的菌絲體晶亮、形態(tài)寬、扁平，且呈螺旋狀扭曲，但各處理菌絲形態(tài)無(wú)顯著差異(圖2)。

圖1 羊肚菌菌絲和菌核形態(tài)

圖2 微量元素及其組配對(duì)菌絲形態(tài)的影響

2.3 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌氨基酸類(lèi)型的影響

2.3.1 對(duì)羊肚菌氨基酸成分含量的影響 由表2可知，在羊肚菌中檢測(cè)到的7 類(lèi)人體必需氨基酸(EAA)組分中，以亮氨酸(Leu)含量較高，但除甲硫氨酸(Met)外，各EAA 組分含量差距較小。 總EAA 含量各處理表現(xiàn)為Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＞CK，與CK 相比，各微量元素處理增幅為1.25%～10.87%，且Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn 處理分別顯著提高10.87%、7.93%、6.12%、8.38%。 在10 類(lèi)人體非必需氨基酸(NEAA)組分中，谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)是組成NEAA 的主要成分，三者總和占總NEAA 含量的56.16%～59.14%。 總NEAA含量表現(xiàn)為Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Fe、Zn＋Fe＞Zn＞CK，其中Zn 處理與CK 無(wú)顯著差異，其余各處理較CK 顯著增加2.09%～6.73%。各處理總氨基酸含量規(guī)律與總NEAA 規(guī)律基本一致。

表2 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌氨基酸成分含量的影響 (%)

2.3.2 對(duì)羊肚菌中呈味氨基酸含量的影響 羊肚菌的鮮味來(lái)自于天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，甜味主要來(lái)自絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)。 由圖3A 可知，鮮味氨基酸總量以Mn 處理最高，CK、Zn、Fe、Zn＋Fe、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn 較其分別降低1.18、0.89、0.82、0.69、0.62、0.96、0.76 個(gè)百分點(diǎn)。由圖3B 可知，甜味氨基酸總量以Zn＋Fe＋Mn 處理最高，顯著高于其他處理，而其他各處理表現(xiàn)為Mn＞Fe＋Mn＞Zn＞Zn＋Mn＞Fe＞Zn＋Fe＞CK，但處理間均無(wú)顯著差異。

圖3 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌中呈味氨基酸含量的影響

2.3.3 對(duì)羊肚菌中藥用氨基酸含量及EAA/NEAA 值的影響 藥用氨基酸類(lèi)型主要包括賴(lài)氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。 由圖4A可知，不同微肥處理間羊肚菌中藥用氨基酸含量存在一定差異，其含量占總氨基酸含量的62.70%～65.15%，谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是藥用氨基酸的主要成分。 不同處理間，藥用氨基酸含量表現(xiàn)為Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＞CK＞Zn，其中Mn 處理顯著大于CK、Zn 處理。 由圖4B 可知，與CK 相比，施用微量元素均可提高羊肚菌EAA/NEAA 值，增幅為1.11%～4.01%，其中，以Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn 處理的EAA/NEAA 值較高，三 者無(wú)顯著差異但均顯著大于CK、Zn、Fe 處理。

圖4 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌中藥用氨基酸含量及EAA/NEAA 值的影響

2.4 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

由圖5 可知，羊肚菌中各營(yíng)養(yǎng)成分含量因微量元素處理不同而表現(xiàn)出較大差異。 其中粗多糖含量以施Mn 相關(guān)處理較高，且表現(xiàn)為Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn；與CK 相比，上述處理粗多糖含量分別增加1.64、1.58、1.11、0.90 個(gè)百分點(diǎn)，其中Fe＋Mn 與CK 無(wú)顯著差異(圖5A)。 由圖5C 可知，各處理粗脂肪含量由高到低表現(xiàn)為Zn＋Fe＋Mn＞Mn＞Fe＞CK＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＞Zn，但處理間均無(wú)顯著差異。 粗蛋白、粗纖維含量皆以Fe＋Mn 處理含量最高，F(xiàn)e＋Mn 處理粗蛋白較其他處理增加0.48%～7.27%，粗纖維含量則增加6.16%～15.89%，且Fe＋Mn 處理兩指標(biāo)值均顯著高于CK(圖5B、D)。

圖5 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

2.5 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌子實(shí)體產(chǎn)量的影響

由圖6 可知，施用微量元素均提高了羊肚菌子實(shí)體產(chǎn)量，各處理間表現(xiàn)為Fe＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＋Mn＞Mn＞Zn＞CK。 與CK 相比，微量元素各處理產(chǎn)量提高3.79%～15.37%，與Fe＋Mn 處理相比，CK、Zn、Mn、Zn＋Mn、Fe、Zn＋Fe、Zn＋Fe＋Mn 分別降低13.32%、10.04%、9.23%、8.50%、5.17%、4.05%、3.69%。 此外，F(xiàn)e＋Mn 處理與CK差異顯著，且二者分別與其他處理均無(wú)顯著差異。

圖6 微量元素及其組配對(duì)羊肚菌子實(shí)體產(chǎn)量的影響

3 討論與結(jié)論

微量元素是生物體生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的礦質(zhì)養(yǎng)分，可改善生物體細(xì)胞原生質(zhì)的膠體化學(xué)性質(zhì)，提高和改善相關(guān)生物體的生長(zhǎng)、產(chǎn)量與品質(zhì)[15]。 鋅(Zn)、鐵(Fe)、錳(Mn)是羊肚菌子實(shí)體含量較高的3 種微量元素，但目前關(guān)于三者對(duì)羊肚菌菌絲發(fā)育及產(chǎn)質(zhì)的功能作用知之甚少[16]。本研究結(jié)果表明，在Zn、Fe、Mn 及其組配處理與CK 之間菌絲特征沒(méi)有明顯差異，但微量元素處理均不同程度促進(jìn)了菌絲體的生長(zhǎng)和菌核的形成，這表明Zn、Fe、Mn 對(duì)羊肚菌孢子萌發(fā)及菌絲發(fā)育均發(fā)揮著積極作用。 這與前人研究結(jié)果基本一致:即Fe、Mo 是影響野生羊肚菌繁殖的重要土壤因子[11]。 此外，研究結(jié)果進(jìn)一步表明，含Mn 處理(Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率、菌絲活力及菌核形成的積極效應(yīng)更優(yōu)，且Fe＋Mn 處理最優(yōu)，表明Fe 與Mn 存在協(xié)同作用。

在氨基酸營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)中，人體必需氨基酸(EAA)的組成與含量是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要參考[17]。 本研究結(jié)果表明，CK 與微量元素處理的氨基酸組成豐富、種類(lèi)齊全，但各氨基酸含量、比重高低不一，且甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)含量均較低，這種氨基酸組成含量會(huì)顯著影響氨基酸的整體利用率，導(dǎo)致其他EAA 在體內(nèi)不能被充分利用而產(chǎn)生浪費(fèi)[14，18]。 整體而言，各處理總EAA 含量表現(xiàn)為Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＞CK，且含Mn 處理(Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn)較CK 顯著提高6.12%～10.87%。

WHO/FAO 中，氨基酸組成模式是進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛用于各類(lèi)食用菌的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)分析[19]。 根據(jù)FAO/WHO 推薦標(biāo)準(zhǔn)，人體必需氨基酸與非必需氨基酸(NEAA)的比例(EAA/NEAA)需高于0.465[20]。 本研究結(jié)果中，EAA/NEAA 為0.450 ～0.468，其中Mn、Zn＋Mn、Fe＋Mn分別為0.468、0.467、0.466，表明Mn 及其與Zn 或Fe 組配施用更有利于提高EAA/NEAA 值。 此外，藥用氨基酸、鮮味氨基酸和甜味氨基酸總量整體以含Mn 處理較高，表明施用Mn 肥可提高羊肚菌中呈味氨基酸含量，提高藥用價(jià)值，這是羊肚菌爽口、味道鮮美及保健效果較好的重要原因。

微量元素是重要催化酶、大分子物質(zhì)及香味物質(zhì)的重要媒介[21]，因此可影響羊肚菌的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。 本研究中，Mn、Fe＋Mn 處理下粗多糖、粗蛋白和粗纖維含量整體較高，表明二者處理有利于提升羊肚菌的食用口感；同時(shí)粗脂肪與CK 無(wú)顯著差異，這可滿足健康食品的要求。 產(chǎn)量是反映羊肚菌生長(zhǎng)、養(yǎng)分總含量及保障經(jīng)濟(jì)收入的重要指標(biāo)。 本研究中，各處理產(chǎn)量由高到低依次為Fe＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＋Mn＞Mn＞Zn＞CK，即微量元素均可提高羊肚菌子實(shí)體產(chǎn)量，但僅Fe＋Mn 處理較CK 產(chǎn)量顯著提高15.37%。

綜上，Mn 肥對(duì)羊肚菌早期菌絲發(fā)育及最終營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)均有重要作用，整體而言Mn 與Fe 組配(Fe＋Mn)效果最佳，其可有利于菌絲體發(fā)育和菌核形成，羊肚菌子實(shí)體氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)效果較佳，且可保障產(chǎn)量提高。