徐培 王佳 陶冶 張晨 夏巖

摘 要：目的：探討miR-1271-5p靶向F13A1基因?qū)谇击[狀細(xì)胞癌增殖和凋亡的調(diào)控作用。方法：培養(yǎng)OSCC細(xì)胞系SCC154細(xì)胞和人正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞NHOK，檢測(cè)miR-1271-5p、F13A1的表達(dá)。將細(xì)胞分為mimics NC組、mimics miR-1271-5p組，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，RT-qPCR 和WB檢測(cè)F13A1的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-1271-5p與F13A1的靶向關(guān)系。將細(xì)胞分為mimics NC組、mimics miR-1271-5p組、mimics miR-1271-5p+OE-F13A1組，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：與人正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞NHOK比，OSCC細(xì)胞miR-1271-5p表達(dá)降低，F(xiàn)13A1表達(dá)升高。相比于mimics NC組，mimics miR-1271-5p組細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增加，F(xiàn)13A1表達(dá)顯著降低（P<0.05），inhibitors miR-1271-5p組F13A1表達(dá)顯著升高（P<0.05）。相對(duì)于mimics miR-1271-5p組，過(guò)表達(dá)F13A1逆轉(zhuǎn)miR-1271-5p對(duì)OSCC的抗增殖和促凋亡作用（P<0.05）。結(jié)論：miR-1271-5p靶向F13A1基因抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：口腔鱗狀細(xì)胞癌；miR-1271-5p；F13A1；增殖；凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)：R739.8 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?文章編號(hào)：1673-260X（2023）07-0024-05

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔癌的主要類(lèi)型，口腔癌90%由鱗狀細(xì)胞癌構(gòu)成[1，2]。microRNA已被廣泛認(rèn)為與癌細(xì)胞抵抗化療干預(yù)的能力有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)microRNA與OSCC的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[3]。近年來(lái)對(duì)microRNA在OSCC中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[4，5]。據(jù)報(bào)道，miR-1271-5p參與許多人類(lèi)癌癥的進(jìn)展，如miR-1271-5p被證實(shí)在卵巢癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[7]、前列腺癌[8]、胃癌[9]等疾病發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。如研究表明miR-1271-5p在卵巢癌中抑制腫瘤發(fā)生[10]。此外，龍健等[11]發(fā)現(xiàn)miR-1271-5p靶向負(fù)調(diào)控FSCN1的表達(dá)，miR-1271-5p通過(guò)對(duì)FSCN1的調(diào)控從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，有望成為肺癌的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

凝血因子13（Coagulation Factor XIII，F(xiàn)13）是一種異酶原四聚體，參與凝血、傷口愈合、血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。研究表明F13A1可能與OSCC的轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]，血栓形成相關(guān)的基因F13A1編碼因子的功能性DNA多態(tài)性與口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[13]。miR-1271-5p在OSCC中的作用尚未明確，且miR-1271-5p對(duì)F13A1的作用也未見(jiàn)報(bào)道。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-1271-5p與F13A1具有潛在靶向關(guān)系，但miR-1271-5p是否通過(guò)靶向F13A1調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌尚未可知。本研究將探討miR-1271-5p靶向F13A1基因?qū)谇击[狀細(xì)胞癌的調(diào)控作用，旨在為發(fā)現(xiàn)新的口腔癌治療方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

OSCC細(xì)胞系（Tca8113、SNU899、SCC154）和正常人類(lèi)口腔角質(zhì)形成細(xì)胞株（NHOK）購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC， Rockville， Maryland， USA）；Eagle培養(yǎng)基、10%胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；轉(zhuǎn)染載體購(gòu)自genchemhem（上海，中國(guó)）；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TRIzol、MTT試劑盒購(gòu)自賽默飛生物科技公司；雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；一抗、二抗均購(gòu)自Abcam公司；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）購(gòu)自美國(guó)BD公司；qRT-PCR基因檢測(cè)試劑盒（QPG-023）購(gòu)自Takara；熒光定量PCR儀（ABI7500）購(gòu)自上海派克生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

OSCC細(xì)胞系Tca8113、SNU899、SCC154和正常人類(lèi)口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（NHOK）在37°C的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞提前1天以3.0×105細(xì)胞/皿的密度播種到60mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí)。分為mimics NC組、mimics miR-1271-5p組、inhibitors miR-1271-5p、mimics miR-1271-5p+OE-F13A1組，依照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)SCC154中miR-1271-5p、F13A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

取復(fù)蘇后的SCC154，加入1ml TRIzol提取RNA，根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，依照Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行反應(yīng)體系設(shè)置。參照ABI7500型定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，基因引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取上述各組細(xì)胞，以1×103個(gè)/ml的密度接種于96孔板，每組3個(gè)重復(fù)。分別在不同時(shí)間段24h、48h、72h加入20μl的MTT溶液，細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后振蕩混勻置于酶標(biāo)儀，檢測(cè)490nm處吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞濃度為1×106時(shí)，用75%乙醇固定細(xì)胞；用預(yù)冷PBS洗滌2次，懸浮在1×Annexin緩沖液中，加入5μl Annexin V-FITC以及15μL PI染液，室溫下黑暗保存15分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)

用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，用雙二酚酸蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。采用12% SDS PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%（w/v）脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)。洗膜后，加入一抗孵育4℃過(guò)夜，TBST沖洗，加入二抗室溫下孵育1小時(shí)。TBST沖洗后利用ECL試劑顯色并拍照儲(chǔ)存。Imagel J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶驗(yàn)證miR-1271-5p和F13A1的靶向關(guān)系

StarBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測(cè)miR-1271-5p和F13A1之間的結(jié)合位點(diǎn)，并利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)并合成野生型序列（WT-F13A1）和突變型序列（MT-F13A1），然后分別與mimics NC或mimics miR-1271-5p共轉(zhuǎn)染到OSCC細(xì)胞中。同時(shí)將mimics NC、mimics miR-1271-5p、inhibitors miR-1271-5p共轉(zhuǎn)染至OSCC細(xì)胞中。孵育48h后，根據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)均表示為x±s，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組及以上組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC細(xì)胞系中miR-1271-5p低表達(dá)，F(xiàn)13A1高表達(dá)

與正常細(xì)胞系NHOK相比，OSCC細(xì)胞系Tca8113、SNU899中miR-1271-5p表達(dá)水平明顯增加（P<0.05），而SCC25的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。qRT-PCR和WB檢測(cè)SCC25細(xì)胞中F13A1表達(dá)，與對(duì)照組相比，SCC25細(xì)胞中F13A1表達(dá)明顯升高（P<0.05）。后續(xù)選擇SCC154進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

與mimics NC組相比，mimics miR-1271-5p組細(xì)胞增殖活力顯著降低，細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)（P<0.05）。

2.3 miR-1271-5p靶向負(fù)調(diào)控F13A1的表達(dá)

Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-1271-5p與F13A1之間存在直接結(jié)合位點(diǎn)。相對(duì)于共轉(zhuǎn)染MT-F13A1與mimic-NC，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-F13A1與miR-1271-5p mimic時(shí)熒光素酶活性明顯降低（P<0.05）。與mimic-NC組相比，mimics miR-1271-5p組F13A1表達(dá)被抑制（P<0.05），inhibitors miR-1271-5p組F13A1表達(dá)顯著升高（P<0.05）。

2.4 過(guò)表達(dá)F13A1逆轉(zhuǎn)miR-1271-5p對(duì)OSCC的抗增殖和促凋亡作用

與對(duì)照組相比，mimics miR-1271-5p顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P<0.05），mimics miR-1271-5p+OE-F13A1和對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明F13A1可以逆轉(zhuǎn)miR-1271-5p過(guò)表達(dá)對(duì)OSCC的抗增殖和促凋亡影響。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是頭頸部癌癥中最常見(jiàn)的一種，在中南亞人群中發(fā)病率最高，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升，全球5年生存率保持在50%左右[14]。本研究檢測(cè)了OSCC細(xì)胞系SCC154細(xì)胞和人正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞NHOK中miR-1271-5p、F13A1的表達(dá)，并驗(yàn)證了miR-1271-5p與F13A1之間的靶向關(guān)系，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-1271-5p抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)F13A1逆轉(zhuǎn)miR-1271-5p對(duì)OSCC的抗增殖和促凋亡作用。

凝血因子13（Coagulation Factor XIII，F(xiàn)13）是一種異酶原四聚體，也稱(chēng)纖維蛋白穩(wěn)定因子，是轉(zhuǎn)谷氨酞胺酶（TGases）家族其中一員[15]。FXIII-A基因（F13A1）在骨髓和間充質(zhì)系細(xì)胞中表達(dá)，尤其是巨核細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、計(jì)時(shí)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞[16]。王淮等[17]利用生物信息學(xué)方法對(duì)F13A1的CpG島、啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)F13A1存在多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，參與細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞成分組成。Li等[18]在血清外泌體（SE）中鑒定出F13A1的表達(dá)與陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)量顯著相關(guān)，預(yù)測(cè)可以幫助OSCC轉(zhuǎn)移的診斷。Vylliotis等[13]研究血栓形成相關(guān)的基因編碼因子F13A1等的功能性DNA多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)與OSCC的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。研究證明F13A1可作為肺癌患者潛在的新的診斷和治療靶點(diǎn)[19]。此外，有報(bào)道F13A1還可作為結(jié)直腸癌篩查的新生物標(biāo)志物[20]。本研究證實(shí)F13A1在OSCC中高表達(dá)，且與miR-1271-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告顯示miR-1271-5p與F13A1具有直接靶向關(guān)系，過(guò)表達(dá)miR-1271-5p顯示F13A1表達(dá)下降，表明miR-1271-5p可能靶向調(diào)節(jié)F13A1的表達(dá)。

miR-1271-5p近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥調(diào)控中具有關(guān)鍵作用，Han等[21]研究表明miR-1271-5p通過(guò)調(diào)控下游靶基因TIAM1抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。根據(jù)Zhang等[22]研究，LncRNA ZFAS1/miR-12 71-5p/HK2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。王勇等[23]研究表明miR-1271-5p通過(guò)干擾DOCK1基因明顯抑制腎癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，有望成為未來(lái)RCC治療的分子靶標(biāo)。為了研究miR-1271-5p在OSCC中的作用，本研究過(guò)表達(dá)miR-1271-5p后，OSCC細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。繼續(xù)過(guò)表達(dá)F13A1后，逆轉(zhuǎn)miR-1271-5p對(duì)OSCC的抗增殖和促凋亡作用。表明miR-1271-5p可以通過(guò)靶向負(fù)調(diào)節(jié)F13A1的表達(dá)進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。這與龍健等[11]研究miR-1271-5p對(duì)肺癌細(xì)胞的作用結(jié)果一致。表明miR-1271-5p對(duì)口腔癌的調(diào)控具有關(guān)鍵作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-1271-5p具有抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。miR-1271-5p可以靶向負(fù)調(diào)節(jié)F13A1的表達(dá)，過(guò)表達(dá)F13A1逆轉(zhuǎn)miR-1271-5p對(duì)OSCC的抗增殖和促凋亡作用。因此，我們推測(cè)miR-1271-5p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)節(jié)F13A1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。但本實(shí)驗(yàn)僅涉及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有做近一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，具有一定的局限性，有待深入的研究證實(shí)。

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