河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

朱文淵 杜彥芳△(石家莊 050017)

提要 目的：探討歸腎丸對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)小鼠卵巢功能和自噬的影響。方法：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、歸腎丸低、中、高劑量組。除正常組外，各組小鼠采用腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)法建立DOR小鼠模型并給予相應(yīng)藥物。ELISA法檢測血清抗苗勒管激素(AMH)、促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)水平；HE染色觀察卵巢組織形態(tài)；Western blot、qRT-PCR檢測卵巢組織微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin 1、p62蛋白和mRNA水平。結(jié)果：與正常組相比，模型組小鼠血清FSH、LH水平升高(P<0.05)，AMH、E2水平降低(P<0.05)；卵巢中生長卵泡和原始卵泡的數(shù)量減少，閉鎖卵泡增加；卵巢組織LC3和Beclin 1蛋白和mRNA水平增高，p62蛋白和mRNA水平降低。經(jīng)歸腎丸干預(yù)后，DOR小鼠血清中FSH和LH激素水平降低(P<0.05)，AMH和E2激素水平增高(P<0.05)；卵巢形態(tài)改善，原始卵泡和生長卵泡增多，閉鎖卵泡減少；卵巢組織中LC3和Beclin 1的蛋白及mRNA水平降低，p62蛋白及mRNA水平升高。結(jié)論：歸腎丸可以明顯改善DOR小鼠的卵巢功能，可能通過抑制卵巢組織自噬發(fā)揮作用。

卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)是發(fā)生在女性40歲之前，卵巢內(nèi)可募集的卵泡數(shù)量和卵母細(xì)胞質(zhì)量均有下降，卵巢功能隨之減退的一種疾病，是導(dǎo)致患者生育能力下降的主要原因[1]，嚴(yán)重影響患者的生殖健康和生活質(zhì)量，若不及時(shí)、盡早的干預(yù)，可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)展為卵巢早衰。有證據(jù)表明，線粒體自噬參與卵泡閉鎖，將導(dǎo)致卵巢衰老[2-3]，可見自噬在DOR的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

《婦人規(guī)》記載：“經(jīng)候不調(diào)，病皆在腎經(jīng)。”腎為先天之本，與天癸、沖任密切相關(guān)，腎主持調(diào)控月經(jīng)。中醫(yī)認(rèn)為DOR的主要病機(jī)是腎虛，在治療上常提倡補(bǔ)腎為主?！毒霸廊珪分杏涊d歸腎丸有補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血之功效，且臨床應(yīng)用治療DOR療效較好[4]。本研究以歸腎丸為代表方，研究歸腎丸對(duì)DOR小鼠卵巢組織自噬的影響，探討歸腎丸通過抑制自噬改善卵巢功能的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠50只，小鼠均為6～8周齡，體質(zhì)量18～25 g。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要藥物 歸腎丸主要組成：熟地黃、山茱萸、山藥(炒)、菟絲子、枸杞子、杜仲(鹽炒)、當(dāng)歸、茯苓。購自國藥樂仁堂石家莊醫(yī)藥有限公司。將藥物分別溶解至0.07 g/mL、0.14 g/mL、0.28 g/mL低中高濃度，4℃冷藏保存，備用。注射用環(huán)磷酰胺：購自MCE公司，HY-17420。

1.3 主要試劑 抗體LC3(Proteintech公司，貨號(hào)：14600-1-AP)，抗體Beclin 1(Proteintech公司，貨號(hào)：11306-1-AP)，抗體p62(Affinity公司，貨號(hào)：AF5384)，抗體GAPDH(Proteintech公司，貨號(hào)：60004-1-Ig)，HRP兔二抗(Proteintech公司，貨號(hào)：SA00001-2)，HRP鼠二抗(Proteintech公司，貨號(hào)：SA00001-1)，小鼠血清FSH(Elisa Biotech公司，EIA-2424)、AMH(Elabscience公司，E-EL-M3015)、E2(Elabscience公司，E-OSEL-M0002)、LH(Elisa Biotech公司，EIA-2348)檢測試劑盒。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型建立 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，記錄動(dòng)情周期。選擇具有規(guī)律動(dòng)情周期的40只小鼠納入實(shí)驗(yàn)，將小鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、歸腎丸低劑量組、歸腎丸中劑量組、歸腎丸高劑量組，每組8只。正常組給予等體積生理鹽水腹腔注射。模型組、歸腎丸低、中、高劑量組一次性腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺(CTX)75 mg/kg進(jìn)行造模，并連續(xù)監(jiān)測動(dòng)情周期7 d，出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂為造模成功。造模成功后，歸腎丸低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量歸腎丸0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃28 d，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。

2.2 ELISA法檢測小鼠血清中抗苗勒管激素(AMH)、促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)的含量 小鼠麻醉后取血，之后在室溫環(huán)境下靜置1 h，4℃ 3 000 r/min離心20 min，提取上層血清，分別按照小鼠血清AMH、FSH、E2、LH檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.3 HE染色觀察各組小鼠卵巢形態(tài) 將經(jīng)4%多聚甲醛固定的小鼠卵巢組織進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、蘇木素染液染色、伊紅染色等步驟，70%乙醇漂洗，中性樹膠封片后，在正置顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。

2.4 qRT-PCR檢測小鼠卵巢組織中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin 1、p62 mRNA表達(dá)水平 卵巢組織勻漿，按照試劑盒說明書提取卵巢組織總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，按SYBR qPCR Master Mix使用說明書進(jìn)行PCR。以GAPDH表達(dá)量作為內(nèi)參對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物見表1。

表1 PCR引物序列

2.5 Western blot法檢測小鼠卵巢組織中LC3、Beclin 1、p62的蛋白水平 裂解卵巢組織提取總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用半干式轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后，將膜置于5%TTBS配置的脫脂奶粉液中室溫封閉2 h。采用TTBS洗膜液洗膜，10 min×3次，然后分別用抗LC3(1∶1 000)、Beclin 1(1∶1 000)、p62(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜。次日洗膜后，二抗1∶10 000室溫孵育2 h，TTBS洗膜液洗膜，10 min×3次，再用TBS洗膜1次，5 min。最后用超靈敏多功能成像儀(LAS 4000，美國GE公司)檢測抗原抗體特異性結(jié)合條帶，拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 28.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)變化 正常組卵巢組織可見原始卵泡和生長卵泡，顆粒細(xì)胞排列有序，未見明顯的閉鎖卵泡；與正常組相比，模型組小鼠原始卵泡和生長卵泡較少，閉鎖卵泡較多，顆粒細(xì)胞層次較少，間隙較大；與模型組相比，歸腎丸低、中、高劑量組小鼠生長卵泡及成熟卵泡增多，閉鎖卵泡數(shù)目減少，卵巢實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)有所改善。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.歸腎丸低劑量組；D.歸腎丸中劑量組；E.歸腎丸高劑量組(下同)。圖1 歸腎丸對(duì)DOR小鼠卵巢組織形態(tài)的影響(HE，×200)

3.2 各組小鼠血清AMH、FSH、E2、LH水平 在模型組中，小鼠血清的FSH、LH水平較正常組明顯升高，AMH、E2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，歸腎丸中、高劑量組血清FSH、LH水平降低，AMH、E2水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 歸腎丸對(duì)DOR小鼠血清中AMH、FSH、E2、LH水平的影響

3.3 各組小鼠卵巢組織中LC3、Beclin 1、p62蛋白水平比較 與正常組相比，模型組小鼠卵巢組織中LC3、Beclin 1蛋白水平明顯升高(P<0.05)，p62蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，歸腎丸中、高劑量組LC3、Beclin 1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，p62蛋白水平明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，提示歸腎丸可以抑制DOR小鼠卵巢組織自噬。見圖2、表3。

表3 各組小鼠卵巢LC3、Beclin 1、p62蛋白水平比較

3.4 各組小鼠卵巢組織中LC3、Beclin 1、p62 mRNA水平比較 與正常組相比，模型組卵巢組織中LC3、Beclin 1 mRNA水平明顯升高(P<0.05)，p62 mRNA水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，歸腎丸中、高劑量組LC3、Beclin 1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)，p62 mRNA水平明顯升高(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠卵巢LC3、Beclin 1、p62 mRNA水平比較

4 討論

中醫(yī)理論中，多依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，將DOR歸為“月經(jīng)后期”“血枯”“閉經(jīng)”“經(jīng)水早斷”等范疇，若疾病發(fā)展嚴(yán)重影響生育能力和妊娠結(jié)局，還可以將其歸屬于“不孕癥”或“滑胎”的范疇[5]?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩唬骸芭悠邭q腎氣盛……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！睂?duì)腎-天癸-沖任-胞宮這一生殖軸的生理特點(diǎn)作出了描述?！陡登嘀髋啤芬嘣疲骸敖?jīng)水出諸腎?！蹦I水足則月經(jīng)多，腎水少則月經(jīng)少，說明了腎氣的充盈與否直接影響著經(jīng)血的充盈。腎藏精，為先天之本，生殖之根，若腎中精氣盛，則天癸至如常，月經(jīng)充盈而有子；而若腎虛陰陽失調(diào)，心、肝、脾之氣失和，則易生氣滯、血瘀、痰凝等，造成沖任胞宮失養(yǎng)瘀阻，DOR則隨之發(fā)生[6]。因此，“腎氣虛弱，天癸不充，沖任不盛”是卵巢功能障礙的病理機(jī)制[7]。故臨床以補(bǔ)腎法為治療DOR的經(jīng)驗(yàn)之法，結(jié)合患者體質(zhì)、兼夾證候及月經(jīng)周期辨證論治，從而平衡臟腑氣血陰陽。

歸腎丸出自《景岳全書》，張景岳謂其為“左歸、右歸二丸之次者也”。具有補(bǔ)腎填精、平衡腎中陰陽的功效，用于治療腎水真陰不足、精衰血少之證，常見腰痠腳耎、形容憔悴、遺泄陽衰等證候[8]。歸腎丸由熟地黃、杜仲、山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞子、當(dāng)歸、茯苓8味藥物組成，治療DOR臨床療效較好[9]。方中重用熟地黃滋腎陰、益精髓，填補(bǔ)真陰為君藥；配伍枸杞子甘平益精明目，山茱萸酸溫滋腎益肝為臣藥；更有山藥滋益脾胃，當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)肝，菟絲子、杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、明目益精，茯苓健脾滲濕為佐使藥。諸藥相合，共奏滋補(bǔ)肝腎、益精補(bǔ)血之功。臨床研究表明，歸腎丸可以明顯降低腎虛型DOR不孕癥患者LH、FSH水平，提高竇卵泡數(shù)、最大卵泡直徑、卵巢血流參數(shù)，改善臨床癥狀及卵巢功能，提高妊娠率[4，10]。歸腎丸加減能夠顯著改善腎虛型DOR不孕患者的臨床癥狀，改善其卵巢功能、臨床妊娠率，并可提高血清TGF-β1、GDF-9和BMP-10水平[11]。動(dòng)物研究證實(shí)，歸腎丸可以通過調(diào)控DOR小鼠Oct-4、MVH和Egr-1的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)動(dòng)情周期，提高始基卵泡的數(shù)目[12]。加減歸腎丸可通過影響卵巢組織PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路改善卵巢功能[13]。

自噬是一種自我降解過程，通過消除多余或受損的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來保持細(xì)胞和生物體的穩(wěn)態(tài)，自噬降解產(chǎn)物的過度積累導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡。顆粒細(xì)胞圍繞在卵泡周圍，在卵泡生長、發(fā)育和成熟的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用。在卵泡發(fā)育的各個(gè)階段均發(fā)生著顆粒細(xì)胞自噬，與卵巢疾病的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞的自噬參與了卵泡的閉鎖[3，15]。研究表明，環(huán)磷酰胺的活性代謝物磷酰胺氮芥干預(yù)顆粒細(xì)胞后，提高了活性氧自由基在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，上調(diào)了自噬標(biāo)志性蛋白Beclin 1的表達(dá)，自噬被過度激活，導(dǎo)致卵泡丟失增加[16]。血清激素FSH可通過PI3K-AKT信號(hào)通路抑制轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制氧化損傷誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞自噬[17]。朱芳芳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺腹腔注射誘導(dǎo)的DOR小鼠模型中，LC3B顯著升高，p62降低，DOR小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬過度激活，而麒麟丸可通過抑制DOR小鼠卵巢內(nèi)的過度自噬，抑制始基卵泡的過度激活，閉鎖卵泡數(shù)量減少，卵巢儲(chǔ)備功能從而得到改善。同時(shí)，麒麟丸也可調(diào)控卵巢組織HIF-1α/Bnip3/Beclin1信號(hào)通路保護(hù)卵巢功能，治療DOR[19]。黃欣怡等[20]發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清的干預(yù)可顯著下調(diào)顆粒細(xì)胞中自噬凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，顆粒細(xì)胞的凋亡減少，進(jìn)而改善卵巢儲(chǔ)備功能。王昭等[21]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎養(yǎng)精湯則在mRNA水平降低了Beclin 1和Lc3Ⅱ的表達(dá)，促進(jìn)p62的表達(dá)，顆粒細(xì)胞的自噬得到抑制，各級(jí)卵泡的發(fā)育得到促進(jìn)，卵巢儲(chǔ)備功能從而得到改善。研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以降低化療源性卵巢早衰小鼠顆粒細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低顆粒細(xì)胞凋亡率，保護(hù)卵巢功能[22-24]。本研究顯示CTX造模后小鼠卵巢LC3、Beclin 1表達(dá)升高，p62表達(dá)降低，卵巢出現(xiàn)過度自噬，損傷卵巢功能；歸腎丸干預(yù)后，卵巢組織中LC3、Beclin 1表達(dá)降低，p62表達(dá)升高，逆轉(zhuǎn)了過度自噬狀態(tài)，改善了激素水平。

自噬過多或不及，都有可能造成肌體陰陽失衡，這體現(xiàn)了中醫(yī)理論中的陰陽互根互用、以及陰陽消長平衡，是陰陽平衡的微觀基礎(chǔ)[25]。當(dāng)細(xì)胞自噬過多，代謝產(chǎn)物分解過多，則陽亢；當(dāng)細(xì)胞自噬不及，代謝產(chǎn)物堆積過多，則陰盛[26]。因此，筆者認(rèn)為，歸腎丸可能通過調(diào)控腎陰腎陽的平衡來調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)自噬的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)于防治DOR具有重要的意義。

綜上所述，歸腎丸可能通過抑制CTX誘導(dǎo)卵巢組織自噬，恢復(fù)卵巢功能，以達(dá)到治療DOR的目的，為歸腎丸的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。然而涉及的具體機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，尚待進(jìn)一步研究。