范潘慧，武立偉，孫 偉，王 瑀，高 巍，邢建永，宋經(jīng)元,5，姚 輝,5*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護(hù)重點(diǎn)研究室，北京 100193；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3. 華潤(rùn)三九(六安)中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 六安 237000；4. 華潤(rùn)三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000；5. 中藥資源教育部工程研究中心，北京 100193)

土壤是植物重金屬的主要來(lái)源之一[1]，隨著全球工業(yè)化的進(jìn)程以及人口的快速增長(zhǎng)，廢棄物的排放使得重金屬污染進(jìn)一步加劇，導(dǎo)致植物從土壤環(huán)境中吸收過(guò)量的重金屬離子。金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物對(duì)重金屬的攝取、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(Natural resistance-associated macrophage protein, NRAMP)基因家族編碼多個(gè)膜定位的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與Cd、Pb 等多種重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[2—3]。目前，擬南芥Arabidopsisthaliana[4]、水稻Oryzasativa[5]、煙草Nicotianatabacum[6]、大麥Hordeumvulgare[7]、大豆Glycinemax[8]等植物的NRAMP基因家族均被挖掘報(bào)道。擬南芥中AtNRAMP6參與Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。水稻中OsNRAMP5參與Cd、Pb 的轉(zhuǎn)運(yùn)[2,9]，其過(guò)表達(dá)減少了Cd 從根向芽的轉(zhuǎn)移，從而降低水稻籽粒的Cd 含量[10]；OsNRAMP1的敲除可降低水稻籽粒Cd 含量[5]。此外，藥用植物黃連Coptischinensis中的NRAMP4和NRAMP5基因被證明參與Cd 的吸收[11—12]。這些研究表明，在植物對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中，NRAMP基因家族起著至關(guān)重要的作用。

穿心蓮Andrographispaniculata為爵床科Acanthaceae 穿心蓮屬一年生草本植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶區(qū)域，20 世紀(jì)50 年代引種于我國(guó)廣東、廣西、福建和海南等地區(qū)[13]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫等作用[14]，現(xiàn)代藥理研究表明其主要活性成分為穿心蓮內(nèi)酯，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等多種作用[15]，因此又被稱為“中藥抗生素”[16]。在新冠肺炎流行期間，穿心蓮被用作抗病毒治療的有效藥物而需求激增[17]。然而，由于種植過(guò)程中的農(nóng)藥化肥濫用等問(wèn)題，導(dǎo)致穿心蓮中重金屬含量超標(biāo)問(wèn)題頻出[18]。目前對(duì)于穿心蓮的重金屬污染問(wèn)題的相關(guān)研究報(bào)道較少[19—20]，對(duì)穿心蓮重金屬吸收轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制解析的研究較為欠缺。

本研究基于穿心蓮參考基因組數(shù)據(jù)[21]，篩選鑒定得到7 個(gè)穿心蓮NRAMP基因家族成員，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)及進(jìn)化關(guān)系等方面進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步探討穿心蓮NRAMP基因家族成員對(duì)重金屬脅迫響應(yīng)的具體功能提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 穿心蓮基因組數(shù)據(jù)來(lái)源及其N(xiāo)RAMP 基因家族成員的鑒定

穿心蓮的全基因組數(shù)據(jù)(ASM980555v1)來(lái)源于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/GCF_009805555.1/)[21]，以已知模式物種擬南芥的NRAMP基因家族蛋白序列為索引，利用本地Blastp 在穿心蓮全基因組的蛋白數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)分析，選取E≤10–10的序列；并通過(guò)SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對(duì)Blastp 比對(duì)得到的候選序列進(jìn)行檢索篩選和確認(rèn)。最終，在穿心蓮全基因組中共鑒定獲得7 個(gè)ApNRAMPs 基因，并用于后續(xù)分析。

1.2 ApNRAMPs 基因編碼的蛋白序列的基本理化性質(zhì)分析

將所獲穿心蓮ApNRAMPs 基因家族的蛋白序列上傳至在線網(wǎng)站 ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)和ExPASy(https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)其編碼蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度、分子量、理論等電點(diǎn)和親水性等基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析[22]；并通過(guò)在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF-PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.3 ApNRAMPs 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

將穿心蓮、擬南芥及水稻的NRAMP 蛋白序列導(dǎo)入MEGA 11 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，而后采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ 法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并用Bootstrap 法評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中重復(fù)次數(shù)(Replications)設(shè)定為1000[23]。

根據(jù)ApNRAMPs 基因的CDS 序列及其基因組的DNA 序列，利用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)網(wǎng)站繪制ApNRAMPs基因家族成員的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式圖[24]，通過(guò)NCBI CD-search 功能預(yù)測(cè)ApNRAMPs蛋白結(jié)構(gòu)域。通過(guò)MEME(https://meme-suite.org/)網(wǎng)站完成ApNRAMPs 蛋白序列的保守基序分析[25]。

1.4 ApNRAMPs 蛋白空間結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)

通過(guò)在線網(wǎng)站 SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)分析ApNRAMPs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)[26]；利用SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線分析網(wǎng)站對(duì)ApNRAMPs 蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[27]，并通過(guò)PyMOL 優(yōu)化所預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿心蓮NRAMP 基因家族成員的鑒定及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

以模式植物擬南芥中已知的6 個(gè)NRAMP 蛋白序列為參考，共鑒定獲得7 條穿心蓮NRAMP 蛋白序列，確定其為NRAMP基因家族成員，命名為ApNRAMP1～ApNRAMP7。對(duì)ApNRAMPs 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)ApNRAMPs氨基酸長(zhǎng)度與分子量均十分接近，分別為513～553 aa 和56.00～60.54 kD (表1)。ApNRAMPs 蛋白均有10～12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，所有成員的亞細(xì)胞定位均為細(xì)胞膜(表1)，表明穿心蓮NRAMP基因家族成員可能均參與植物體內(nèi)重金屬的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。

表1 ApNRAMPs 基因家族成員編碼蛋白的理化性質(zhì)Table 1 The physical and chemical properties of the proteins encoded by ApNRAMPs family members

2.2 穿心蓮NRAMP 基因家族成員進(jìn)化分析

將7 個(gè)ApNRAMPs 編碼的蛋白序列與模式物種擬南芥中6 個(gè)AtNRAMPs 和水稻中7 個(gè)OsNRAMPs編碼的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。穿心蓮、擬南芥和水稻的NRAMP基因家族，共計(jì)20 條序列被分為2 個(gè)亞組：GroupⅠ和GroupⅡ(圖1)。其中穿心蓮ApNRAMP1/2/7 屬于GroupⅠ，并包含有擬南芥AtNRAMP1/6 和水稻OsNRAMP1/3/4/5/6；而穿心蓮ApNARMP3/4/5/6 和擬南芥、水稻中的其余NRAMP 成員聚類(lèi)于GroupⅡ。此外，從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，ApNRAMP1 和ApNRAMP2聚為一支，ApNRAMP5 和ApNRAMP6 聚為一支，展現(xiàn)出較短的進(jìn)化距離。

圖1 穿心蓮、擬南芥和水稻NRAMP 基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of NRAMP gene family members among Andrographis paniculata, Arabidopsis and Oryza sativa

2.3 穿心蓮NRAMP 基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)分析穿心蓮ApNRAMPs 基因的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該基因家族的所有成員均含有完整的Nramp 結(jié)構(gòu)域，具有極強(qiáng)的保守性。在穿心蓮的7個(gè)ApNRAMPs 基因中，ApNRAMP3～ApNRAMP6均含有3 個(gè)內(nèi)含子，而ApNRAMP1、ApNRAMP2、ApNRAMP7則含有12 個(gè)內(nèi)含子(圖2)。

圖2 ApNRAMPs 基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)Fig. 2 Gene structure of ApNRAMPs

2.4 穿心蓮NRAMP 基因家族編碼蛋白的保守基序分析

為進(jìn)一步分析穿心蓮NRAMP基因家族成員在編碼蛋白水平的差異，本研究采用MEME 在線分析工具對(duì)7 個(gè)ApNRAMPs 基因編碼蛋白的保守基序進(jìn)行分析，共獲得16 個(gè)Motif (圖3)。不同ApNRAMPs基因的基序數(shù)量相近，12～14 個(gè)不等。所有穿心蓮NRAMP 家族成員蛋白質(zhì)序列均包含Motif 1～8 和Motif 13。ApNRAMP1、ApNRAMP2、ApNRAMP7均含有Motif 12 和Motif 13，而ApNRAMP4、ApNRAMP5、ApNRAMP6 含有Motif 11，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，ApNRAMP1/2/7 屬于 Group Ⅰ，而ApNRAMP4/5/6 屬于GroupⅡ一致。

圖3 ApNRAMPs 蛋白保守基序分析Fig. 3 Conservative motifs of ApNRAMPs proteins

2.5 穿心蓮NRAMPs 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在ApNRAMPs 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋及無(wú)規(guī)則卷曲占比最大，分別占比49.17%～60.23%和25.93%～31.80%，延伸鏈和β-折疊的氨基酸數(shù)目最少，分別占比10.53%～15.71%和2.71%～4.07%(表2)。使用SWISS-MODEL 在線模擬ApNRAMPs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用Pymol 對(duì)預(yù)測(cè)得到的ApNRAMPs 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，ApNRAMPs 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似，并主要由α-螺旋所構(gòu)成(圖4)。

圖4 ApNRAMPs 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4 The 3D structures analysis of ApNRAMPs proteins

表2 穿心蓮NRAMP 家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)件占比Table 2 The percentage of secondary structure of NRAMP family proteins in Andrographis paniculata

3 結(jié)論與討論

作為中醫(yī)藥的發(fā)源地，中國(guó)是中藥資源大國(guó)，但中醫(yī)藥的發(fā)展受到中藥安全問(wèn)題的困擾，其中重金屬污染問(wèn)題尤為嚴(yán)重[29]。作為南藥大品種之一的穿心蓮，由于其抗炎、抗菌等明確的療效，近年來(lái)市場(chǎng)需求遞增[13]。為了降低重金屬污染，提高穿心蓮品質(zhì)，了解重金屬在穿心蓮體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制十分重要。NRAMP 是一類(lèi)分布極為廣泛的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)家族，在進(jìn)化過(guò)程中極度保守，并在重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[30]。通過(guò)對(duì)穿心蓮ApNRAMPs 進(jìn)行深入分析，可以較為全面地了解該基因家族成員的特征，闡明其功能，為阻斷穿心蓮對(duì)有害重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)提供思路，對(duì)推動(dòng)其無(wú)公害種植具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在模式植物中，NRAMP基因家族參與重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的功能已有較為深入的研究，為藥用植物響應(yīng)重金屬脅迫的機(jī)制研究提供了很好的借鑒。水稻的OsNRAMP1定位于細(xì)胞膜上，被認(rèn)為參與水稻根系對(duì)Cd 的吸收[5]；OsNRAMP5則對(duì)根系吸收Cd和Pb 發(fā)揮重要作用[2,31]。擬南芥AtNRAMP3定位于液泡膜上，參與液泡中Cd 的外排[32]；AtNRAMP6參與胞內(nèi)Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。在藥用植物中，參與重金屬脅迫響應(yīng)的基因研究才剛剛起步，甘草Glycyrrhiza uralensis和黃連的NRAMP基因家族已被鑒定挖掘[11—12,33]。黃連在受到Cd 脅迫時(shí)，定位于液泡膜上的CcNRAMP3基因在須根中首先大量表達(dá)而后逐漸下降，這與植物中金屬吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的規(guī)律一致，推測(cè)其可能與Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[11]。

本研究從穿心蓮基因組中共鑒定到 7 個(gè)NRAMP基因，命名為ApNRAMP1～ApNRAMP7，對(duì)其蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該家族成員的氨基酸序列長(zhǎng)度相近，均定位于細(xì)胞膜上，含有10～12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。植物NRAMP 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域不僅將其錨定到生物膜上，還發(fā)揮了維持生物學(xué)功能的作用[34]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，NRAMP基因家族可分為2 個(gè)亞家族(圖1)，穿心蓮和水稻、擬南芥等植物的NRAMP基因家族具一致的進(jìn)化方向。此外，ApNRAMPs 家族成員的基因結(jié)構(gòu)顯示，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)被分為兩個(gè)不同亞家族的成員在保守基序和基因結(jié)構(gòu)上也存在顯著差異，這與擬南芥、水稻和大豆中的NRAMP基因結(jié)構(gòu)相近[6]，暗示植物的NRAMP基因家族可以較為明顯的分為兩個(gè)類(lèi)群以及該家族基因結(jié)構(gòu)的保守性。ApNRAMPs 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，所有成員的三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似。上述結(jié)果有助于更加深入地了解穿心蓮ApNRAMPs 的結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)抗性品種篩選奠定基礎(chǔ)。未來(lái)可通過(guò)轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)手段獲得低Cd 吸收的穿心蓮新品種，實(shí)現(xiàn)穿心蓮的無(wú)公害種植[13,29]。