伍順達，梁綺雯，孫 敏，王思遠，蘇 益，肖浪濤

(湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128)

花生Arachishypogaea是一種廣泛種植的重要經(jīng)濟和油料作物，我國花生總產(chǎn)量和消費量均穩(wěn)居世界之首[1]。近年來，我國花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，播種面積超過465 萬 hm2，約占世界花生種植面積的17.8%，花生年產(chǎn)量達1752 萬t，約占全國油料總產(chǎn)量的一半，是世界花生總產(chǎn)量的39%[2]。花生是一種異源多倍體的豆科作物，其基因組由兩個二倍體亞基因組組成，即Arachisipaensis和Arachisduranensis。由于其倍性差異、花粉育性低和雜交不親和等障礙，傳統(tǒng)的花生育種周期較長，花生高產(chǎn)、高營養(yǎng)、抗蟲害等性狀的篩選需要新技術(shù)獲得突破[3—4]。分子標記技術(shù)是獲取花生遺傳多樣性的有效手段，常用的技術(shù)包括隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)、擴增多態(tài)性DNA (AFLPs)、序列特征擴增區(qū)(SCARs)和簡單序列重復序列(SSRs)等。前人利用PCR 技術(shù)在栽培花生中生成了111 個AFLP 標記，其中有3%標記具有多態(tài)性[5]，使用308種AFLP 引物組合鑒定了花生蓮座叢病中與蚜蟲載體抗性相關(guān)的標記，構(gòu)建了第一個栽培花生的部分遺傳連鎖圖譜[6]。有學者利用SSR 標記對中國花生品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進行評估，揭示了中國南北方花生栽培品種的遺傳變異[7—8]。隨著花生全基因組和花生基因組數(shù)據(jù)庫等生物信息學資源的不斷完善[9—10]，花生遺傳學、基因組學和分子育種取得重要進展。然而，相比于其他糧油作物，花生的基礎(chǔ)研究還相對滯后，遺傳轉(zhuǎn)化體系為主要瓶頸之一。早期研究主要通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染[11]或基因槍[12—13]的方法來獲得花生的轉(zhuǎn)基因植株。不同外植體，如子葉節(jié)、下胚軸、葉節(jié)和合子胚軸都能應(yīng)用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化程序[14—19]。

原生質(zhì)體沒有細胞壁，能快速進行種群增長且具有同步性，仍保留了其時空表達的特異性。通過植物原生質(zhì)體細胞培養(yǎng)，結(jié)合一些精細的遺傳操作技術(shù)如顯微注射、體細胞雜交、細胞融合等，可以替代傳統(tǒng)技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因操作，從而獲得不同的遺傳變異類型，為優(yōu)良品種的創(chuàng)制和選育提供便捷途徑[20—23]。然而，花生的原生質(zhì)體分離技術(shù)還不系統(tǒng)、完善，分離效率不高。本研究分別使用混合酶解液和崩潰酶制備花生原生質(zhì)體，同時對比兩種方法的酶解效果，改進花生原生質(zhì)體的分離條件，為基于原生質(zhì)體的花生遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選用多粒型四粒紅A.hypogaeavar.fastigiate‘Silihong’?；ㄉN后，在30 ℃黑暗條件下催芽，自然光照下室外盆栽種植。

1.2 試劑儀器

1.2.1 試劑與耗材

KCl、CaCl2、NaCl 購自國藥集團化學試劑有限公司(上海)；纖維素酶(cellulase)、果膠酶(pectinase)、離析酶R-10 (macerozyme R-10)均購自麥克林生化科技有限公司(上海)；崩潰酶(driselase)購自Sigma-Aldrich(上海)；牛血清蛋白(BSA)購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；D-甘露醇(D-mannitol)、2-嗎啉乙磺酸(MES)購自北京索萊寶科技有限公司；臺盼藍購自北京酷來搏科技有限公司。細胞濾網(wǎng)(40 μm)購自北京蘭杰柯科技有限公司，血球計數(shù)板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.2.2 儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(Eppendorf 5415R、Sartorius SIGMAI-15K)、低速冷凍離心機(Eppendorf 5810R)、全溫振蕩器(HZQ-QX)、分析天平(SHIMADZU AUX220)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(W-201B)、顯微鏡(BS303)。

1.3 溶液配制

預處理液：0.02 mol·L–1KCl、0.02 mol·L–1MES、0.01 mol·L–1CaCl2、0.6 mol·L–1甘露醇和0.1% BSA；現(xiàn)配現(xiàn)用。

W5 溶液：154 mmol·L–1NaCl，125 mmol·L–1CaCl2，25 mmol·L–1KCl 和2 mmol·L–1MES，pH 5.7。

酶解液：酶解液 M1 (1%纖維素酶+2%果膠酶+1%離析酶R-10)；酶解液M2 (1.5%纖維素酶+2%果膠酶+1%離析酶R-10)；酶解液M3 (2%纖維素酶+2%果膠酶+1%離析酶R-10)；酶解液M4 (2%纖維素酶+1%果膠酶+1%離析酶R-10)；酶解液M5 (2%纖維素酶+1.5%果膠酶+1%離析酶 R-10)；酶解液M6 (2%纖維素酶+3%果膠酶+1%離析酶 R-10)。

混合酶解液配制：稱取酶粉后加入100 μL 2 mol·L–1KCl、1 mL 0.2 mol·L–1MES 和7.5 mL 0.8 mol·L–1甘露醇。將混合物55 ℃水浴10 min，使蛋白酶失活，冷卻至室溫后加入100 μL 1 mol·L–1CaCl2和200 μL 5% BSA。加入ddH2O，定容至10 mL。

酶解液 M7 (0.2 g 崩潰酶溶于 10 mL 0.6 mol·L–1甘露醇溶液中，用0.1 mol·L–1HCl 調(diào)整pH 至5.2，4 ℃避光混勻30 min 活化崩潰酶)，4500 r·min–1離心10 min，取上清。

臺盼藍溶液：稱取4 g 臺盼藍粉末，加100 mL ddH2O 溶解，過濾后4 ℃ 保存。使用時用磷酸緩沖液稀釋至0.04%。

1.4 原生質(zhì)體制備

取花生60 d 齡植株尚未展開的復葉、黃化葉、盛開的花瓣、幼嫩果針以及幼苗下胚軸，用75%乙醇清理樣品表面，用刀片將其切成0.5～1.0 mm 細條狀，置于預處理液中，抽真空10 min，吸去預處理液，再加入酶解液，固定在搖床上50 r·min–1、28 ℃避光酶解3 h。酶解完成后，加入1 mL W5 溶液中止酶解反應(yīng)，用40 μm 細胞濾網(wǎng)過濾去除未消化的植物組織，700 r·min–1離心10 min，棄上清。吸取2 mL W5 溶液將原生質(zhì)體重懸。隨后冰上靜置20 min，健康的原生質(zhì)體沉降于試管底部，去除上清。用500 μL W5 溶液重懸沉淀，吸取少量原生質(zhì)體懸浮液于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)。

1.5 計數(shù)方法

原生質(zhì)體計數(shù)：吸取10 μL 原生質(zhì)體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù) 3 次以上，取平均值，可得出 1 mL懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)為25 個中方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)×104。

原生質(zhì)體產(chǎn)量(個·g–1)=原生質(zhì)體密度(個·mL–1)× 純化后原生質(zhì)體體積(mL)/葉片質(zhì)量(g)[24]。

1.6 臺盼藍染色

吸取10 μL 用0.04%臺盼藍染色后原生質(zhì)體于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)每種酶解液配方的原生質(zhì)體，重復3 次。原生質(zhì)體活性(%)=(未染色的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合酶解液對原生質(zhì)體制備的影響

植物的各個部位都能制備原生質(zhì)體，但幼嫩組織往往是首選材料。本研究選用幼嫩的花生葉片為材料(圖1A、B)。不同混合酶解液對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和狀態(tài)具有重要影響。在果膠酶濃度不變的情況下，隨纖維素酶濃度升高，花生葉片的原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加；在纖維素酶濃度一定的情況下，隨著果膠酶濃度的增加，樣品的酶解效果變好，原生質(zhì)體的產(chǎn)量增加。由圖1 可知，不同的酶解液組合均能獲得原生質(zhì)體，其中酶解液M6，即 2%纖維素酶+3%果膠酶+1%離析酶R-10 的酶組合，花生葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量為 1.35×105個·g–1，且原生質(zhì)體飽滿透亮，形態(tài)完整。因此，2%纖維素酶+3%果膠酶+1%離析酶R-10 是分離花生葉片原生質(zhì)體的最佳酶解條件。

圖1 不同酶液組合的原生質(zhì)體數(shù)目及產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of enzyme combinations on protoplast number and yield

2.2 不同組織原生質(zhì)體的分離效果比較

原生質(zhì)體的產(chǎn)量和質(zhì)量取決于樣品的來源，不同組織獲取原生質(zhì)體的難易程度不同。除了葉片的原生質(zhì)體(圖2 A)，本研究制備了花生的花瓣、果針、幼苗下胚軸以及幼苗黃化葉等的原生質(zhì)體。其中，花瓣與黃化葉均能分離得到大量原生質(zhì)體(圖2 B～C)，花生苗的下胚軸雖然能分離得到原生質(zhì)體，但鏡檢時視野可見細胞極少(圖2 D)，而未能從果針中分離得到原生質(zhì)體。

圖2 花生不同組織分離的原生質(zhì)體Fig. 2 Protoplasts from different tissues of peanut

2.3 不同酶處理對花生原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

崩潰酶是一種從真菌-擔子菌中提取出來的復合酶，內(nèi)含昆布多糖酶、木聚糖酶和纖維素酶等，也具有消解植物細胞壁的功能。本研究在同等條件下使用混合酶液以及崩潰酶制備原生質(zhì)體，對比混合酶液和崩潰酶之間的分離效果(圖3)。使用崩潰酶制備原生質(zhì)體，花生葉片消化不完全，收集到的原生質(zhì)體少，每1 g 葉片僅獲得約1.17×105個細胞，且細胞大多成團聚集，單個的游離細胞較少?；旌厦敢篗6 的酶解效果明顯優(yōu)于崩潰酶，每1 g 葉片能獲得約5.93×105個細胞(圖3)，游離的原生質(zhì)體飽滿透亮。對于花生花瓣而言，混合酶的酶解效果同樣優(yōu)于崩潰酶，混合酶液M6 處理花瓣3 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量為 2.55×105個·g–1，而崩潰酶處理僅有5.35×104個·g–1。因此，混合酶液要比崩潰酶更能在短時間獲得較多的原生質(zhì)體。

圖3 不同酶處理對花生原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of different enzyme treatments on protoplast yield

2.4 原生質(zhì)體活性分析

正常的活細胞具有完整的細胞膜結(jié)構(gòu)，臺盼藍染料不能夠進入細胞內(nèi)；而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，細胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色。分析臺盼藍染色結(jié)果，經(jīng)過M6 處理后，從花生花瓣中分離得到的原生質(zhì)體有超過98%細胞未被染色，即具有活性的原生質(zhì)體細胞比例超過98%(圖4)。

圖4 花生花瓣原生質(zhì)體臺盼藍染色Fig. 4 Vitality detection of protoplasts from peanut petals

3 討論

植物原生質(zhì)體可通過機械法和酶解法來獲得[25]。1892 年Klercker 等[26]最先通過研磨的機械方法從藻類植物中得到完整的原生質(zhì)體。酶解法可以通過應(yīng)用不同的酶來消解細胞壁，從而釋放出大量完整的原生質(zhì)體[27]。植物細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)，因此一般選擇纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶等來制備原生質(zhì)體。酶液的濃度配比對花生原生質(zhì)體的制備至關(guān)重要，所遵循的原則應(yīng)是利用盡可能低的酶濃度，在盡可能短的酶解時間內(nèi)，獲取大量有活力的原生質(zhì)體。

不同組織獲取原生質(zhì)體的難易程度不同，使用的酶濃度及酶解時間都有所區(qū)別。最早的花生原生質(zhì)體是從幼苗和葉片中獲得的[28—29]，早期使用酶解的方式制備花生原生質(zhì)體時間長達16 h，隨著纖維素酶、半纖維素酶等酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)不斷革新，花生原生質(zhì)體的制備也越來越容易，Biswas 等[30]用3%纖維素酶RS+0.1%離析酶+0.5%果膠酶，黑暗中酶解5 h，從5 日齡的花生未展開葉片中獲得大量原生質(zhì)體；Liu 等[4]使用3%纖維素酶R-10+1.5%離析酶R-10+0.3%果膠酶Y-23 處理7 日齡黃化苗葉片成功獲得原生質(zhì)體；Wang等[31]使用1%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.5%果膠酶進行第一次酶解，純化后再用1.2%纖維素酶R-10+0.4%離析酶二次酶解后成功獲得果針的原生質(zhì)體。本研究通過調(diào)整酶解液配方(2%纖維素酶+3%果膠酶+1%離析酶 R10)，在3 h 內(nèi)從1 g 花生植株的葉片中獲得約5.93×105個原生質(zhì)體。由于取樣的葉片是室外超過60 d 花生植株未展開的復葉，相較于之前的方法，本研究配方降低了纖維素酶濃度，提高了果膠酶和離析酶濃度，從而酶解花生葉片獲得活性較好的原生質(zhì)體。該配方使得制備花生原生質(zhì)體的材料不僅僅局限于易酶解的幼苗或者黃化苗，其可以根據(jù)需要通過不同處理或者不同部位獲得花生較成熟植株的葉片原生質(zhì)體。

高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原生質(zhì)體的獲得首先依賴于選擇合適的植物組織。對于豆科作物如鷹嘴豆Cicerarietinum和豇豆Vignaunguiculata而言，完全展開的葉片是原生質(zhì)體分離的最佳選擇[32]。就花生而言，在酶解液M6處理下，能在3 h內(nèi)從未展開的葉片中分離得到大量原生質(zhì)體，花生的花瓣和黃化葉片也是制備原生質(zhì)體的合適材料，而幼嫩果針和花生苗下胚軸未能獲得大量原生質(zhì)體。本研究優(yōu)化了花生原生質(zhì)體分離條件，為探索花生原生質(zhì)體再生系統(tǒng)建立和遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。