徐新龍 楊杰 李玉龍 李蘭 莫善明 劉佳麗

摘 要：生活飲用水中的微生物指標(biāo)是判定水質(zhì)安全合格與否的重要指標(biāo)之一，提升實(shí)驗(yàn)室生活飲用水中水質(zhì)微生物項(xiàng)目的檢測能力，可為海關(guān)執(zhí)法和政策制定提供科學(xué)依據(jù)。本文依據(jù)GB/T 5750.12—2006中微生物指標(biāo)檢驗(yàn)方法和本次能力驗(yàn)證計(jì)劃的參試作業(yè)指導(dǎo)書要求，采用平皿計(jì)數(shù)法對樣品1#、2#中菌落總數(shù)進(jìn)行檢測，采用多管發(fā)酵法對樣品3#、4#中的總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，4項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目的|Z|≤2，獲得“滿意”結(jié)果。通過參加該能力驗(yàn)證計(jì)劃項(xiàng)目，分析與總結(jié)了能力驗(yàn)證檢測過程中的注意事項(xiàng)與質(zhì)量控制要求，有效評價(jià)了實(shí)驗(yàn)室操作人員的檢測能力水平。

關(guān)鍵詞：生活飲用水；菌落總數(shù)；大腸菌群；能力驗(yàn)證；質(zhì)量控制

Abstract： The microbial index of domestic drinking water is one of the important indicators to determine whether the water quality is safe or not. Improving the detection ability of the laboratory’s microbial project of domestic drinking water quality can provide a scientific basis for customs law enforcement and policy formulation. In accordance with the requirements of GB/T 5750.12—2006 microbial index test method and the operation instruction for participation in this capacity verification plan， this paper uses the plate counting method to detect the total number of colonies in sample 1# and 2#， and uses the multi tube fermentation method to detect the total coliform， heat resistant coliform and Escherichia coli in sample 3# and 4#. The results showed that |Z|≤2 of the 4 inspection items obtained a “satisfactory” result. By participating in the proficiency testing program， the precautions and quality control requirements during the proficiency testing process were analyzed and summarized， and the testing ability level of laboratory operators was effectively evaluated.

Keywords： drinking water; total number of colonies; total coliform; proficiency testing; quality control

水是不可或缺的寶貴自然資源，自然界中的水往往含有各類雜質(zhì)及多種微生物，如果直接飲用，將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體遭受不同程度的破壞，從而引發(fā)各種類型的疾病，嚴(yán)重時(shí)可危及生命[1]。微生物群是水是否被污染的重要指示物，可將生活飲用水和水源水中的微生物，如大腸菌群等檢驗(yàn)結(jié)果作為判斷水質(zhì)合格與否，以及水傳染病流行的預(yù)警信息[2]。菌落總數(shù)、大腸菌群、銅綠假單胞菌等是生活飲用水中的主要微生物指標(biāo)，可根據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2006）規(guī)定的檢測方法及其他標(biāo)準(zhǔn)開展檢驗(yàn)[3]。

能力驗(yàn)證是指利用實(shí)驗(yàn)室間比對，并按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價(jià)參加者的能力[4]。它是判斷和監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室能力、并使實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系有效性與效率得到持續(xù)改進(jìn)與不斷提高的重要途徑，經(jīng)常被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的外部質(zhì)量控制活動(dòng)中，其結(jié)果可用于新建方法的證實(shí)、人員數(shù)據(jù)分析能力的培養(yǎng)、人員檢測能力考核、設(shè)備操作及管理等[5]。阿拉山口海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)植食品紡織實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按《能力驗(yàn)證領(lǐng)域和頻次表》（CNAS—AL 07：2015）規(guī)定[6]，每年都積極參加國內(nèi)外食品微生物領(lǐng)域能力驗(yàn)證活動(dòng)，穩(wěn)步提升了該實(shí)驗(yàn)室的微生物檢測能力與水平。

1 材料與方法

1.1 測試樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株

待檢測樣品為4份西林瓶真空包裝的白色塊狀凍干粉末，菌落總數(shù)樣品檢測標(biāo)識1#、2#，總大腸菌群、耐熱大腸菌群及大腸埃希菌樣品檢測標(biāo)識3#、4#：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心；大腸埃希氏菌（ATCC 25922），上海寶錄科技有限公司。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar，NA）；乳糖蛋白胨；伊紅美藍(lán)瓊脂（Eosin Methylene Blue Agar，EMB）；革蘭氏染色液；EC培養(yǎng)基；EC-MUG培養(yǎng)基，北京陸橋公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-160生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；CL-40M高壓滅菌器（日本ALP公司）；NU-404-400E生物安全柜（美國NUAIRE公司）；HH.S21-4電熱恒溫水浴鍋（上海博迅）；Eclipse Ci-L顯微鏡（日本尼康公司）。

1.4 檢驗(yàn)方法

按照參試能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書與實(shí)驗(yàn)室獲認(rèn)可方法《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2006）進(jìn)行檢測。

1.4.1 樣品再水化

依據(jù)指導(dǎo)書用220 mL無菌水對參試樣品進(jìn)行再水化。取出4 ℃低溫冷藏樣品，待其溫度與室溫達(dá)到平衡后，在生物安全柜內(nèi)開啟裝有樣品1#、2#的西林瓶，先加入無菌水10 mL，待凍干粉完全溶解后，將其吸出并移至另一無菌瓶中，加無菌水反復(fù)潤洗西林瓶的內(nèi)表面，回收清洗液至無菌瓶內(nèi)，最后充分混勻，此溶液即等同于220 mL的待測生活飲用水樣品原液。樣品3#、4#處理方法同前述，但需將再水化加入無菌水體積改為20 mL。

1.4.2 菌落總數(shù)檢測方法

將樣品1#、2#用MS3渦旋混勻器充分混勻，再用一次性無菌移液管吸取該原液各1 mL，分別注入直徑9 cm的一次性無菌培養(yǎng)皿中，將121 ℃高壓滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻至45 ℃左右，傾注至培養(yǎng)皿的低刻度線處，即約15 mL，旋緊搖勻，保證二者充分混勻，同法接種平行樣品培養(yǎng)皿。無菌吸取1 mL待測水樣置于9 mL滅菌生理鹽水管中，充分混勻制成1∶10（V∶V）稀釋液，吸取1 mL 1∶10（V∶V）稀釋液注入9 mL滅菌生理鹽水管中，混勻即得1∶100（V∶V）稀釋液，同上連續(xù)梯度稀釋制成1∶1 000（V∶V）稀釋液，接種方法同上，另取空白培養(yǎng)皿加入營養(yǎng)瓊脂作為空白對照。待所有平皿凝固后，將其倒置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)36 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.4.3 總大腸菌群乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

多管發(fā)酵法：取10.0 mL樣品3#、4# 分別接種含10 mL雙料乳糖蛋白胨溶液的試管5支；取1 mL樣品3#、4#分別接種含10 mL單料乳糖蛋白胨溶液的試管5支；取1.0 mL樣品3#、4#加至含9 mL滅菌生理鹽水的管中，吸取混勻后的液體1.0 mL（即0.1 mL），分別接種含10 mL單料乳糖蛋白胨溶液的試管5支，所有試管內(nèi)均置有小倒置管。接種完畢后置于36 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵后產(chǎn)酸產(chǎn)氣的陽性管分別在伊紅美藍(lán)平板上做連續(xù)劃線法接種，36 ℃培養(yǎng)24 h培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，革蘭氏染色與鏡檢后進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)發(fā)酵證實(shí)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 耐熱大腸菌群檢測

采用多管發(fā)酵法檢測水中耐熱大腸菌群?？偞竽c菌群產(chǎn)酸產(chǎn)氣陽性者，用接種環(huán)挑取一環(huán)管中液體，接種EC培養(yǎng)基管，置于恒溫水浴槽中44.5 ℃培養(yǎng)24 h，同時(shí)接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，于44.5 ℃培養(yǎng)24 h，具有典型菌落形態(tài)的樣品則證實(shí)為陽性。

1.4.5 多管發(fā)酵法檢測水中大腸埃希氏菌檢測

采用多管發(fā)酵法檢測水中大腸埃希氏菌。用接種環(huán)挑取經(jīng)證實(shí)為總大腸菌群陽性試管中的液體，接種到EC-MUG管中，置于恒溫水浴槽中44.5 ℃培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)完畢后的EC-MUG管放在暗處用紫外燈照射（波長336 nm，功率6 W）觀察，有藍(lán)色熒光的樣品則為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)結(jié)果

菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果與被檢樣品的稀釋度倍數(shù)成反比，且同一樣品稀釋度的兩個(gè)平行樣之間差異越小，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對準(zhǔn)確；空白對照無菌落生長，則表明實(shí)驗(yàn)過程無污染，實(shí)驗(yàn)條件成立，結(jié)果有效[7]。在實(shí)驗(yàn)過程中為確保有適宜的稀釋度在可計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)選取了原液、10-1、10-2、10-3 4個(gè)稀釋度，參試樣品的平行樣一和平行樣二分別計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，選二者平均值作為最終報(bào)告數(shù)，結(jié)果見表1。最終報(bào)告1#樣品的菌落總數(shù)為119 CFU·mL-1，2#樣品的菌落總數(shù)為120 CFU·mL-1。

2.2 總大腸菌群檢測結(jié)果

總大腸菌群多管發(fā)酵法檢測結(jié)果見表2。從表2可以看出，樣品3#、4#經(jīng)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后，部分試管變黃變混濁，內(nèi)置倒置管中出現(xiàn)氣泡，或出現(xiàn)絮狀沉淀，均帶有糞臭味。用伊紅美藍(lán)瓊脂平板將初發(fā)酵陽性管劃線培養(yǎng)后，呈深紫黑色、圓形的典型菌落，略微帶有金屬光澤，染色及鏡檢為革蘭氏陰性（G-）、兩端鈍圓、無芽孢桿菌。經(jīng)查表最終報(bào)告為3#樣品的總大腸菌群數(shù)為540 MPN/100 mL，4#樣品的總大腸菌群數(shù)為1 600 MPN/100 mL。

2.3 耐熱大腸菌群及大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)結(jié)果

耐熱大腸菌群及大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法檢測結(jié)果見表3。由表3可以看出，將經(jīng)總大腸菌群證實(shí)實(shí)驗(yàn)確定的陽性管轉(zhuǎn)種EC發(fā)酵管后均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，轉(zhuǎn)種EMB平板后均出現(xiàn)典型菌落生長；將上述陽性管再接種EC-MUG管后也均產(chǎn)生藍(lán)色熒光。經(jīng)查表最終報(bào)告為3#樣品的耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)結(jié)果為540 MPN/100 mL，4#的耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)結(jié)果為1 600 MPN/100 mL。

2.4 能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

依據(jù)此次能力驗(yàn)證提供者反饋的|Z|值對結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，|Z|值≤2.0為滿意結(jié)果，2.0＜|Z|值＜3.0為可疑結(jié)果，|Z|值≥3.0為離群結(jié)果[8]。如表4所示，實(shí)驗(yàn)室此次上報(bào)能力驗(yàn)證結(jié)果的|Z|值均＜2.0，并且|Z|值相對都較小，評價(jià)結(jié)果均為結(jié)果滿意。

3 結(jié)論與討論

綜上所述，實(shí)驗(yàn)室參加本次CNAS能力驗(yàn)證提供者組織的生活飲用水中菌落總數(shù)，以及總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌能力驗(yàn)證計(jì)劃，4項(xiàng)參數(shù)的|Z|值均≤2.0，取得滿意結(jié)果。此次能力驗(yàn)證項(xiàng)目均屬定量檢驗(yàn)，需報(bào)送具體參數(shù)，相較于定性檢驗(yàn)來說，具有一定難度。近年來，微生物檢測領(lǐng)域檢測能力驗(yàn)證項(xiàng)目的難度不斷增大，檢測周期安排也更為緊湊，除前期準(zhǔn)備及結(jié)果報(bào)告的時(shí)間，基本僅留有完成一次完整檢測周期的時(shí)間，不容復(fù)測。這就需要操作人員認(rèn)真對待每一次能力驗(yàn)證，提前做好各項(xiàng)準(zhǔn)備，合理優(yōu)化檢驗(yàn)流程，并對檢測過程中的各類影響因素進(jìn)行必要的質(zhì)量控制。

能力驗(yàn)證是評價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)能力的重要依據(jù)，通過參加能力驗(yàn)證有助于發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室存在的各類問題并加以改進(jìn)。例如，方瑩等[9]通過參加生活飲用水微生物檢測項(xiàng)目的能力驗(yàn)證，依據(jù)組織方反饋的Z值總結(jié)了總大腸菌群多管發(fā)酵法和膜過濾法兩種方法之間的優(yōu)劣，分析了再水化時(shí)間、加樣量、培養(yǎng)條件等檢驗(yàn)過程中可能存在的問題，有效評價(jià)了3名參試檢驗(yàn)員的業(yè)務(wù)能力水平。而實(shí)際工作中影響生活飲用水中微生物檢測結(jié)果的因素較多，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，需要做好前期準(zhǔn)備工作，并從檢測環(huán)境、儀器、過程、人員及誤差等方面進(jìn)行質(zhì)量控制[10]。結(jié)合上述能力驗(yàn)證結(jié)果，本文重點(diǎn)對此次能力驗(yàn)證檢測過程中的注意事項(xiàng)和各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制要求進(jìn)行了討論。

（1）能力驗(yàn)證樣品送達(dá)后，操作人員應(yīng)檢查樣品包裝是否存在破損、內(nèi)容物是否齊全和完好等。并嚴(yán)格按照參試指導(dǎo)書中規(guī)定方法操作，操作過程中盡量安排兩名以上檢驗(yàn)員進(jìn)行獨(dú)立操作。操作人員要提前熟悉每個(gè)操作步驟及細(xì)節(jié)，并注意生物安全，避免樣品液污染。檢測相關(guān)儀器設(shè)備均需檢定或校準(zhǔn)，并符合檢測結(jié)果的量值溯源要求[11-12]。

（2）實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基質(zhì)量的判斷對于保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、科學(xué)與公正至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)選擇適宜的制備方法、滅菌和儲存方式，并按規(guī)定對其進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證最終檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]。例如，本次能力驗(yàn)證過程中使用到的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液需注意單雙料稱樣量的變化，營養(yǎng)瓊脂、EC培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基需121 ℃滅菌15 min，乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC-MUG培養(yǎng)基則因成分不同需115 ℃滅菌20 min，經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基還應(yīng)關(guān)注其pH值的變化，避免因培養(yǎng)基質(zhì)量問題而影響檢測結(jié)果。

（3）檢樣稀釋度選擇恰當(dāng)與否直接關(guān)系到檢測結(jié)果的可靠性[14]。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)參試指導(dǎo)書或生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的限量要求，在預(yù)先判斷樣品受污染程度高低的基礎(chǔ)上選擇適宜的稀釋度。針對能力驗(yàn)證分發(fā)的盲樣，在樣品前處理時(shí)采用漩渦混勻器混勻，提升樣液的均勻度[15]。本次實(shí)驗(yàn)過程中選擇了4個(gè)適宜的樣品稀釋度，每個(gè)稀釋度均設(shè)置另一平行樣，以防止因平板蔓延或其他原因不能讀數(shù)。此外，在應(yīng)用多管發(fā)酵法對小于1 mL樣品液進(jìn)行接種處理時(shí)，應(yīng)通過逐級遞增稀釋的方法完成稀釋處理，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性[16]。

（4）在菌落總數(shù)讀數(shù)方面，可在平板培養(yǎng)過程中分時(shí)段多次觀察，詳細(xì)觀察菌落在平板上的生長情況，按時(shí)做好記錄，防止出現(xiàn)菌落蔓延生長的情況。最終讀數(shù)時(shí)，盡量安排多人同讀，避免漏讀甚至讀錯(cuò)。對于總大腸菌群等多管發(fā)酵計(jì)數(shù)，應(yīng)帶有標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株對待檢樣品的陰、陽性進(jìn)行判斷，發(fā)酵過程中可適當(dāng)延遲培養(yǎng)時(shí)間，防止漏讀一些發(fā)酵較慢的菌，對于初發(fā)酵單個(gè)產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的可疑管均需要進(jìn)行復(fù)發(fā)酵和確證實(shí)驗(yàn)，觀察EC-MUG熒光時(shí)，也應(yīng)多人一起判讀，保證結(jié)果的可靠性[15]。在報(bào)告結(jié)果時(shí)，除了按照參試指導(dǎo)書中限定或規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求外，還應(yīng)該按照隨附的能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告單中規(guī)定要求報(bào)告結(jié)果。結(jié)果報(bào)告單應(yīng)由檢驗(yàn)員、復(fù)核人員及授權(quán)簽字人進(jìn)行三級校核，避免出現(xiàn)不必要的錯(cuò)誤，并經(jīng)由授權(quán)簽字人最終審核無誤后簽發(fā)報(bào)告[17]。

（5）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量負(fù)責(zé)人需要對能力驗(yàn)證提供者反饋的Z值結(jié)果認(rèn)真地進(jìn)行分析總結(jié)，并且對檢測過程中的某些突出問題進(jìn)行針對性糾正和預(yù)防，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測能力的不斷提升，確保實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系得到持續(xù)有效運(yùn)行，并獲得不斷改進(jìn)，從而增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室在海關(guān)系統(tǒng)及檢測市場中的競爭力與影響力。近年來，得益于參加各類微生物檢測能力驗(yàn)證計(jì)劃活動(dòng)，阿拉山口海關(guān)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理體系不斷規(guī)范，檢測人員業(yè)務(wù)能力水平進(jìn)一步提高，實(shí)驗(yàn)室微生物檢測能力得到了穩(wěn)步提升。

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