人重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 增強(qiáng)急性視神經(jīng)損傷大鼠模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的保護(hù)作用

耿 巖,崔曉萌,王 爽

（1. 北京積水潭醫(yī)院眼科，北京 100035；2. 北京積水潭醫(yī)院回龍觀院區(qū)眼科，北京 100035）

視神經(jīng)損傷多繼發(fā)于外傷性視神經(jīng)病變或青光眼等[1]，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）發(fā)生逆行性凋亡；由于RGCs 軸突再生能力差，最終造成不可逆的視力障礙或永久性失明[2]，因此預(yù)防RGCs 凋亡有望成為防止視神經(jīng)損傷后退變的重要策略[3]。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型研究表明，核因子E2 相關(guān)因子2/血紅素氧合酶-1/BTB-CNC 同源體1（nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase-1/BTB-CNC homology 1，Nrf2/HO-1/Bach1）通路是一個(gè)對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥的關(guān)鍵信號(hào)通路，在受損RGCs 保護(hù)中起著重要作用[4-5]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，NRG-1）是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族中的一員，軸突衍生的NRG-1 信號(hào)與酪氨酸激酶受體ErbB2/ErbB4 或ErbB2/ErbB3 受體異源二聚體相互作用，導(dǎo)致酪氨酸激酶磷酸化，促進(jìn)下游信號(hào)傳導(dǎo)，參與成人神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷及相關(guān)疾病的治療提供了新的途徑[6]。但是目前關(guān)于NRG-1 是否參與急性視神經(jīng)損傷的調(diào)節(jié)尚不明確。故本研究利用鉗夾法建立大鼠視神經(jīng)損傷模型，探索人重組NRG-1 對(duì)預(yù)防大鼠視神經(jīng)損傷和RGCs 凋亡、促進(jìn)視神經(jīng)修復(fù)的效果，并基于Nrf2/HO-1/Bach1 信號(hào)通路進(jìn)一步探究其可能的機(jī)制，以期為預(yù)防視神經(jīng)退化提供有效的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及倫理學(xué)批準(zhǔn) 50 只雄性SD 大鼠（體質(zhì)量200～250 g，鼠齡8～10周，SPF級(jí)）購(gòu)自中國(guó)（北京）食品藥品檢定研究院[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0017]。大鼠在無(wú)特定病原體動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，自由飲水和飲食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京積水潭醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（DL2021-092)，并嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)期間盡量減少動(dòng)物的痛苦和傷害。

1.1.2 主要試劑及儀器 人重組NRG-1 蛋白（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天有限公司）；NRG-1及Nrf2、Bach1、HO-1一抗和相應(yīng)二抗（美國(guó)Abcam公司）；手術(shù)顯微鏡OMS-85和透射電鏡J-1230型（日本拓普康公司）；眼科顯微手術(shù)器械（蘇州醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型制作及分組 將50只大鼠隨機(jī)分為5 組（n=10）：假手術(shù)組（模擬手術(shù)過(guò)程，但不損傷視神經(jīng)；術(shù)后玻璃體注射無(wú)菌生理鹽水），模型組（利用動(dòng)脈夾夾持法損傷視神經(jīng)；術(shù)后玻璃體注射無(wú)菌生理鹽水），NRG-1 0.5 μg、1.0 μg、3.0 μg 組（利用動(dòng)脈夾夾持法損傷視神經(jīng)；術(shù)后玻璃體分別注射0.5 μg、1.0 μg、3.0 μg 人重組NRG-1 蛋白）。大鼠在20～25 ℃、12 h 光照周期和適宜濕度條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。根據(jù)曹霞等[7]的方法建立視神經(jīng)損傷大鼠模型：用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，劑量為2 mL/kg，手術(shù)眼（每只動(dòng)物均以右眼為手術(shù)眼）結(jié)膜下注射20 g/L利多卡因局部麻醉。將大鼠俯臥在手術(shù)臺(tái)上，于雙目顯微鏡下切開(kāi)外眼眥韌帶，打開(kāi)Tenon 囊，分離外直肌并剪斷，沿顳側(cè)鞏膜表面鈍性分離，暴露視神經(jīng)。模型組和NRG-1 組大鼠于眼眶后2～3 mm 處用動(dòng)脈夾夾持視神經(jīng)15～20 s；而假手術(shù)組大鼠僅暴露視神經(jīng)15～20 s。術(shù)后將眼球復(fù)位，縫合Tenon囊及外眼眥韌帶。于直接檢眼鏡下觀察視網(wǎng)膜血供良好，無(wú)其他部位損傷，則視為造模成功。術(shù)后常規(guī)使用抗生素眼膏涂抹。此外用3 g/L左氧氟沙星滴眼液滴眼，術(shù)后2周每天4次，3周后每天3 次，每次1 滴，至造模結(jié)束。術(shù)后肌肉注射慶大霉素（20 000 U），每天1次，連續(xù)3 d，以防止感染。

在手術(shù)完成30 min 后，用微量注射器進(jìn)行前房穿刺，釋放10～15 μL 房水。然后在角膜緣后0.5～1 mm處穿刺玻璃體。NRG-1 組大鼠分別注射0.5、1.0、3.0 μg 人重組NRG-1 蛋白，每次10 μL。而假手術(shù)組和模型組大鼠以同樣的方式注射等量生理鹽水。直接檢眼鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜血供情況。

1.2.2 閃光視覺(jué)誘發(fā)電位（flash visual evoked potential，F(xiàn)-VEP）檢測(cè) 電生理檢查遵循國(guó)際視覺(jué)臨床電生理學(xué)會(huì)的原則，在術(shù)后2 h、1 d、2 d、7 d、14 d、28 d時(shí)，用100 g/L 的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠后，滴注復(fù)方托品酰胺散瞳。為了充分?jǐn)U瞳，在10 min內(nèi)（直徑5 mm）滴入托吡卡胺-苯腎上腺素滴眼液3次，將角膜電極阻抗置于結(jié)膜囊內(nèi)直接接觸角膜表面20 min。采用銀針電極，阻抗＜2 kΩ，暗適應(yīng)后在暗室內(nèi)打開(kāi)全視野閃光刺激器，刺激光強(qiáng)3 193 CD/m2，刺激頻率119 Hz，通頻帶寬1～100 Hz，記錄P100波潛伏期和波幅。所有參數(shù)值均由眼電生理診斷系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)量，并計(jì)算3 次連續(xù)測(cè)量的平均值。

1.2.3 HE 染色觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化 術(shù)后28 d，將大鼠處死后立即摘除右眼球及視神經(jīng)，眼球固定于多聚甲醛48 h 后，置于梯度酒精中脫水，然后經(jīng)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 霍亂毒素亞單位（cholera toxin subunit B，CTB）示蹤視網(wǎng)膜受壓狀態(tài) 將2 μL CTB 試劑注入大鼠玻璃體后，灌注4%多聚甲醛-PBS（pH 7.4）。然后用微剪和細(xì)鉗對(duì)每只完整的眼進(jìn)行去核，在距角膜邊緣1 mm 的鞏膜上切開(kāi)一小口，取出角膜，解剖顯微鏡下取出玻璃體，同時(shí)在眼杯的下邊緣作一個(gè)小切口為區(qū)分視網(wǎng)膜方向的標(biāo)記，室溫下4%多聚甲醛固定眼杯4 h，根據(jù)之前的標(biāo)記切口在視網(wǎng)膜上、下、顳和鼻側(cè)切開(kāi)4 條線，使視網(wǎng)膜呈花瓣?duì)钫归_(kāi)。顯微鏡下對(duì)皺紋進(jìn)行光滑處理。玻片密封，置于熒光顯微鏡下觀察，并在視網(wǎng)膜上靠近視乳頭的區(qū)域、中間部分和周圍拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件計(jì)算RGCs數(shù)量。

1.2.5 TUNEL 法檢測(cè)RGCs 凋亡情況 各組眼球石蠟切片常規(guī)脫蠟，置于0.3% H2O2-PBS和蛋白酶K混合液中。分別加入1 μL末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶、1 μL地高辛標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、18 μL 標(biāo)記緩沖液，37 ℃下培養(yǎng)2 h。與50 μL 抗地高辛抗體培養(yǎng)30 min 后，加入50 μL 鏈霉親和素-生物素復(fù)合物溶液培養(yǎng)30 min，終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封閉，光鏡下觀察。計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。凋亡細(xì)胞呈棕色或強(qiáng)棕色染色。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo) 在冷凍的視神經(jīng)組織中加入0.2 mL 裂解緩沖液，將視神經(jīng)勻漿在冰上保持30 min，然后在4 ℃下收集上清液，采用相關(guān)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β、NO、NOS、MDA、SOD水平。

1.2.7 免疫組化法檢測(cè)NRG-1 蛋白表達(dá) 各組眼球石蠟切片常規(guī)脫蠟后，用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）高溫抗原熱修復(fù)10 min，3% H2O2溶液滅活處理20 min，5% BSA封閉20 min，加入兔抗鼠NRG-1在4 ℃下孵育過(guò)夜，復(fù)溫后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗孵育，DAB 顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察眼球組織中NRG-1 蛋白染色情況，呈黃色顆粒狀染色或質(zhì)膜染色為陽(yáng)性。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)Nrf2、Batch1、HO-1 蛋白表達(dá) 大鼠視神經(jīng)用預(yù)冷的RIPA 裂解液冰浴裂解后提取總蛋白，用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，神經(jīng)裂解液經(jīng)SDS-PAGE 分離蛋白，并將蛋白條帶半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，加入脫脂牛奶封閉后，分別加入Nrf2、Bach1、HO-1 一抗孵育，經(jīng)二抗孵育后通過(guò)ECL 顯影，總蛋白樣本以GAPDH 為內(nèi)參，核蛋白樣本以Histone H3為內(nèi)參進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRG-1對(duì)P100波潛伏期和波幅的影響

假手術(shù)組P100 波的潛伏期和波幅相對(duì)穩(wěn)定（圖1a）；與假手術(shù)組相比，模型組和NRG-1（0.5 μg、1.0 μg、3.0 μg）組大鼠出現(xiàn)異常波形，呈扁平、寬、不規(guī)則波形，P100 波潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05），波幅降低（P＜0.05）。術(shù)后28 d，模型組和NRG-1 0.5 μg組P100波潛伏期長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0.05），波幅低于假手術(shù)組（P＜0.05）；而NRG-1 1.0 μg組和NRG-1 3.0 μg組P100波幅均顯著高于模型組（P＜0.05），但是與假手術(shù)組相比，差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NRG-1 3.0 μg組P100 波潛伏期顯著短于模型組（P＜0.05），與假手術(shù)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 F-VEP檢測(cè)各組大鼠視神經(jīng)P100波潛伏期和波幅的變化

2.2 NRG-1對(duì)視網(wǎng)膜形態(tài)和病理?yè)p傷的影響

假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜組織從內(nèi)向外依次為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層，排列整齊。模型組大鼠視網(wǎng)膜水腫增厚，以神經(jīng)纖維層最為明顯，且出現(xiàn)空泡；節(jié)細(xì)胞腫脹，大而淺染的細(xì)胞核明顯減少，甚至消失；內(nèi)、外核層細(xì)胞少量減少，排列紊亂；內(nèi)外叢狀層輕度水腫。NRG-1 1.0 μg組和NRG-1 3.0 μg組大鼠視網(wǎng)膜病理?yè)p傷較模型組均有所改善。模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中RGCs數(shù)量及NRG-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于假手術(shù)組（P＜0.05）；NRG-1 1.0 μg組、NRG-1 3.0 μg組大鼠視網(wǎng)膜組織中RGCs數(shù)量及NRG-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2～4。

圖2 HE染色、免疫組化染色觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化以及NRG-1蛋白陽(yáng)性染色情況

圖3 CTB示蹤法檢測(cè)視網(wǎng)膜RGCs的存活情況

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中RGCs細(xì)胞和NRG-1蛋白陽(yáng)性數(shù)比較

2.3 TUNEL法檢測(cè)RGCs凋亡情況

模型組視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織中RGCs凋亡數(shù)多于假手術(shù)組（P＜0.05）；而NRG-1 1.0 μg組和NRG-1 3.0 μg組視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織中RGCs 凋亡數(shù)均明顯少于模型組（P＜0.05），且NRG-1 3.0 μg組凋亡細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織RGCs凋亡情況

2.4 NRG-1 對(duì)視神經(jīng)組織炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、NO、MDA含量均顯著增加（P＜0.05），同時(shí)SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，NRG-1 1.0 μg組和NRG-1 3.0 μg 組大鼠視神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、NO、MDA 含量均降低（P＜0.05），且SOD 水平均升高（P＜0.05）；NRG-1 3.0 μg組上述各項(xiàng)指標(biāo)（除SOD 外）與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NRG-1 0.5 μg 組上述各項(xiàng)指標(biāo)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠視神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、NO、NOS、MDA、SOD水平的影響（，n=10）

表1 各組大鼠視神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、NO、NOS、MDA、SOD水平的影響（，n=10）

*：與假手術(shù)組相比，P＜0.05；#：與模型組相比，P＜0.05

?

2.5 NRG-1對(duì)視神經(jīng)Nrf2/HO-1/Bach1通路的影響

各組大鼠視神經(jīng)組織總蛋白中Nrf2、Bach1 蛋白表達(dá)水平基本一致（P＞0.05）；但是模型組總蛋白中HO-1 以及核蛋白中Nrf2、Bach1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較假手術(shù)組降低（P＜0.05）；而各NRG-1（0.5 μg、1.0 μg、3.0 μg）組總蛋白中HO-1以及核蛋白中Nrf2、Bach1蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠視神經(jīng)組織Nrf2、HO-1、Bach1蛋白表達(dá)（n=10）

3 討論

視神經(jīng)損傷后可誘導(dǎo)RGCs 凋亡、軸突變性和再生能力減退，從而導(dǎo)致視力喪失，目前治療效果和預(yù)后往往難以達(dá)到預(yù)期[8-9]。NRG-1 是重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[10]，本研究采用急性視神經(jīng)損傷大鼠模型，探討外源性補(bǔ)充不同濃度的人重組NRG-1 對(duì)視神經(jīng)損傷程度及功能恢復(fù)的保護(hù)作用。

F-VEP 是監(jiān)測(cè)視神經(jīng)損傷進(jìn)展的有效工具之一，能準(zhǔn)確評(píng)估脫髓鞘化和軸突變性。本研究中模型組大鼠在損傷1 d 即出現(xiàn)P100 波波幅急劇下降；在損傷28 d 后，仍然存在視神經(jīng)損傷。而人重組NRG-1 具有保護(hù)視神經(jīng)，促進(jìn)其功能恢復(fù)的作用，具體表現(xiàn)為P100波潛伏期縮短，波幅增高。說(shuō)明NRG-1參與了視神經(jīng)損傷后細(xì)胞凋亡的保護(hù)和組織修復(fù)過(guò)程，本研究中HE 染色形態(tài)學(xué)結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)果。此前有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后內(nèi)源性NRG-1 表達(dá)在急性損傷早期迅速升高，隨后逐漸下降，說(shuō)明NRG-1 表達(dá)對(duì)損傷敏感[11-12]。這可能是因?yàn)樵谝暽窠?jīng)損傷的早期，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的激活加速了NRG-1 的分泌和釋放，從而負(fù)反饋性保護(hù)RGCs 的存活。而NRG-1 在神經(jīng)損傷晚期表達(dá)下降，可能與其他因素在組織修復(fù)中替代或阻止NRG-1 合成有關(guān)。而在本研究中，我們通過(guò)進(jìn)一步補(bǔ)充外源性人重組NRG-1，結(jié)果顯示，在視神經(jīng)組織過(guò)表達(dá)NRG-1 可有效降低視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織中RGCs 凋亡率，從而維持軸突損傷后再生，增強(qiáng)視神經(jīng)損傷的修復(fù)和保護(hù)作用。

視神經(jīng)病變可導(dǎo)致視功能損傷，引起視力下降或者視力喪失，多與炎癥、脫髓鞘、氧化應(yīng)激或周圍組織的壓迫而導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷有關(guān)[13-14]。因此，視神經(jīng)損傷后周圍炎癥和氧化應(yīng)激引起的繼發(fā)性損傷是視神經(jīng)損傷治療中不可忽視的因素。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中炎癥相關(guān)的指標(biāo)均顯著升高的同時(shí)伴隨氧化應(yīng)激指標(biāo)也發(fā)生顯著變化；然而，給予外源性NRG-1 則可以降低大鼠視神經(jīng)中炎癥因子水平，恢復(fù)正常的氧化應(yīng)激狀態(tài)。Nrf2 是氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，當(dāng)受到氧化應(yīng)激信號(hào)刺激后，會(huì)迅速發(fā)生磷酸化和核移位，進(jìn)而調(diào)控多種抗氧化基因的表達(dá)，通過(guò)刺激生成抗氧化物來(lái)抑制氧化應(yīng)激損傷[15]。Bach1 是Nrf2 的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，能與Nrf2 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗氧化元件，負(fù)調(diào)控HO-1等下游抗氧化基因表達(dá)，在氧化應(yīng)激中也起著重要作用[16]。HO-1 是一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，可被多種氧化和炎癥信號(hào)誘導(dǎo)。因此，HO-1的表達(dá)被認(rèn)為是一種針對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化損傷的適應(yīng)性細(xì)胞反應(yīng)[17]。本研究中，大鼠視神經(jīng)損傷大鼠模型中總蛋白中HO-1 以及核蛋白中Nrf2、Bach1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較假手術(shù)組降低，這說(shuō)明大鼠視神經(jīng)損傷導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡和炎癥反應(yīng)；經(jīng)外源性NRG-1 處理后，HO-1 以及核蛋白中Nrf2、Bach1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著上調(diào)，這證實(shí)NRG-1 具有一定的抗氧化和抗炎作用，其作用機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1/Bach1通路有關(guān)。

綜上，NRG-1 蛋白在大鼠急性視神經(jīng)損傷后期表達(dá)降低明顯，而給予外源性重組人NRG-1 能夠通過(guò)抑制視網(wǎng)膜RGCs凋亡以及激活Nrf2/HO-1/Bach1通路發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，從而減緩急性視神經(jīng)損傷的進(jìn)展，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)和保護(hù)作用。然而，NRG-1/Nrf2/HO-1/Bach1 通路在急性視神經(jīng)損傷中的分子機(jī)制需要在動(dòng)物模型和人體組織中進(jìn)一步探討。