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      蒙藥赤瓟子的提取及其鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究

      2023-10-19 06:22:51唐曉光劉倩陳曉北張聰穎
      關(guān)鍵詞:鎮(zhèn)痛蒙藥抗炎

      唐曉光 劉倩 陳曉北 張聰穎

      摘 要:目的:采用響應(yīng)面法優(yōu)化赤瓟子的提取工藝,評(píng)價(jià)蒙藥赤瓟子乙醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎活性。方法:采用單因素試驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取溫度、液料比、乙醇濃度對(duì)赤瓟子提取率的影響,依據(jù)Box-Behnken組合設(shè)計(jì),確定其最佳提取工藝。采用熱板法和扭體法考察赤瓟子乙醇提取物的鎮(zhèn)痛活性,采用二甲苯致小鼠耳腫脹法和雞蛋清致大鼠足腫脹法考察赤瓟子乙醇提取物的抗炎活性。結(jié)果:赤瓟子最佳提取工藝,液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度分別為15:1ml/g、68%、1h和80℃。蒙藥赤瓟子乙醇提取物能顯著延長(zhǎng)小鼠的痛閾值和扭體的潛伏期,顯著降低冰乙酸誘發(fā)的小鼠扭體次數(shù),顯著抑制雞蛋清所致的大鼠足腫脹和二甲苯所致的小鼠耳腫脹。結(jié)論:蒙藥赤瓟子乙醇提取物具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎活性。

      關(guān)鍵詞:蒙藥,赤瓟子;鎮(zhèn)痛;抗炎

      中圖分類號(hào):R285.5;R289.5? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A? 文章編號(hào):1673-260X(2023)09-0063-05

      赤爮子蒙藥名為敖樂木色,為葫蘆科植物赤瓟Thladiantha dubia Bunge的干燥成熟果實(shí),又名赤雹、氣包、山屎瓜等,廣泛分布于內(nèi)蒙古、東北三省、華北、陜西等地,性甘、酸、平,具有活血、化瘀、調(diào)經(jīng)之功效,常用于陰道疾病、血瘀宮中、血痞、經(jīng)閉、皮膚病等的治療[1]。赤瓟子作為民族藥,不僅作為蒙藥使用,還在滿族民間應(yīng)用,常用來(lái)治療多種疼痛,如腰腿痛、痛經(jīng)、風(fēng)濕痛、乳房脹痛等[2]。研究發(fā)現(xiàn),赤瓟子具有顯著的抗炎活性[3]。目前關(guān)于赤瓟子的報(bào)道主要集中于赤瓟子水提物或其中某類成分的單一藥理作用,而其乙醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎活性報(bào)道較少。本研究通過(guò)熱板法、扭體法評(píng)價(jià)赤瓟子乙醇提取物(CPZE)的鎮(zhèn)痛活性,采用二甲苯和雞蛋清致炎法評(píng)價(jià)CPZE的抗炎活性,為蒙藥赤瓟子的臨床合理應(yīng)用和藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)。

      1 實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)物

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      昆明種小鼠,雌雄各半,SPF級(jí),體質(zhì)量范圍20±2g;SD大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量范圍200~220g,大鼠和小鼠均由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2018-0010。采購(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后,先進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7天,飼養(yǎng)環(huán)境:飼養(yǎng)溫度20~24℃,相對(duì)濕度(55±5)%,通風(fēng)良好,明暗適宜。

      1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

      數(shù)顯水浴鍋(HH-2,江蘇恒?。恍D(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000E,上海尚儀);循環(huán)水真空泵(SHZD-III,河南予華);超聲波清洗機(jī)(KQ-250E,昆山舒美);電子天平(美國(guó),梅特勒AE240);智能熱板儀(成都泰盟科技,RB-200);6mm打孔器;數(shù)顯游標(biāo)卡尺;灌胃針,注射器等。

      1.3 藥品與試劑

      赤瓟子(本品為自采藥用植物,經(jīng)赤峰學(xué)院王洪俠副教授鑒定為赤瓟子的成熟果實(shí)),阿司匹林泡騰片(產(chǎn)品批號(hào):1911168,阿斯利康),冰乙酸(產(chǎn)品批號(hào):20120808,國(guó)藥集團(tuán),分析純),二甲苯(產(chǎn)品批號(hào):20180203,天津天力,分析純),95%乙醇(盤錦天源,分析純),10%雞蛋清溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配,溶劑為生理鹽水),無(wú)菌蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制),生理鹽水等。

      1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量

      熱板法、扭體法、二甲苯致耳腫脹實(shí)驗(yàn)分組:取小鼠80只,雌雄各半(熱板法全部用雌性小鼠),隨機(jī)分成陽(yáng)性對(duì)照組(陽(yáng)性藥為阿司匹林)、CPZE高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白對(duì)照組,以上5組給藥劑量分別為0.03g·kg-1、6g·kg-1、3g·kg-1、1.5g·kg-1和對(duì)應(yīng)濃度等體積的生理鹽水。雞蛋清致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)分組:取SD大鼠72只,雌雄各半,隨機(jī)分6組,在上述分組基礎(chǔ)上增設(shè)模型組,空白對(duì)照組和模型組給予對(duì)應(yīng)濃度同等體積的生理鹽水,CPZE高劑量組、中劑量組和低劑量組給藥劑量應(yīng)根據(jù)小鼠給藥劑量、大鼠體質(zhì)量換算成大鼠的給藥劑量,陽(yáng)性對(duì)照組阿司匹林給藥劑量為人臨床極量根據(jù)大鼠體質(zhì)量換算成大鼠的給藥劑量。

      2 赤瓟子提取工藝實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 赤瓟子提取工藝的優(yōu)化

      2.1.1 藥材預(yù)處理

      赤瓟子打碎過(guò)60目篩,在烘箱內(nèi)恒溫干燥24h,直至重量不再變化。

      2.1.2 赤瓟子的提取

      稱量赤瓟子20g,加適量乙醇浸泡24h,回流提取2次,提取液減壓蒸餾至恒重,按下列公式計(jì)算浸膏質(zhì)量和提取率(%)。

      浸膏質(zhì)量(g)=蒸餾后圓底燒瓶(含浸膏)的質(zhì)量(g)-蒸餾前圓底燒瓶的質(zhì)量(g)

      提取率(%)=(浸膏質(zhì)量÷20g)×100%

      2.1.3 單因素試驗(yàn)

      取赤瓟子粗粉80g,平均分成4份,通過(guò)單因素試驗(yàn)評(píng)價(jià)提取溫度、提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度對(duì)赤瓟子提取率的影響。提取溫度對(duì)赤瓟子提取率的影響:按照液料比15:1mL/g加一定濃度的乙醇,設(shè)定5個(gè)提取溫度(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃),每個(gè)溫度下提取2次,每次提取1h,每個(gè)溫度下實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,計(jì)算平均提取率。提取時(shí)間對(duì)赤瓟子提取率的影響:按照液料比15:1mL/g加一定濃度的乙醇,選擇7個(gè)不同的提取時(shí)間(30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min),在80℃下回流提取,提取次數(shù)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)和提取率計(jì)算同上。液料比對(duì)赤瓟子提取率的影響:選擇6個(gè)不同的液料比,加70%的乙醇,在80℃下回流提取1h,提取次數(shù)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)和提取率計(jì)算同上。乙醇濃度對(duì)赤瓟子提取率的影響:按液料比為15:1mL/g,選擇5個(gè)不同濃度的乙醇為提取溶劑,即50%、60%、70%、80%、90%,在80℃下回流提取1h,提取次數(shù)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)和提取率計(jì)算同上。

      2.2 赤瓟子乙醇提取物的制備

      稱量干燥赤瓟子粗粉500g,加2倍量68%乙醇浸泡24h,用15倍量的68%乙醇在80℃下回流提取2次,每次提取1h,趁熱過(guò)濾,合并提取液,置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾,回收乙醇,蒸至浸膏恒重,稱量適量的CPZE,將其稀釋成6g·kg-1、3g·kg-1、1.5g·kg-1的溶液,即為CPZE的高劑量組、中劑量組和低劑量組。

      2.3 熱板法

      根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中記錄的方法[4],取智能熱板儀,設(shè)置溫度為(55±0.5)℃,待溫度恒定后,將小鼠置于熱板儀中,觀察并記錄小鼠第一次添后足的時(shí)間,該時(shí)間即為小鼠的痛閾值。篩選痛閾值在5~30s內(nèi)的雌性小鼠(即痛閾合格的小鼠)80只,分組及給藥劑量見“1.4”,每日1次,連續(xù)灌胃7d。首次給藥前,在熱板儀上重復(fù)測(cè)量?jī)纱瓮撮撝?,平均值作為各組小鼠的基礎(chǔ)痛閾值。給藥后1h、1.5h、2h再測(cè)各組小鼠痛閾值,若小鼠痛閾值超過(guò)60s,應(yīng)立刻將小鼠取出或停止熱板實(shí)驗(yàn),此時(shí)痛閾值按60s計(jì)算。

      2.4 扭體法

      取小鼠80只,分組及給藥劑量見“1.4”,每日1次,連續(xù)灌胃7d,于末次給藥1h后,各組小鼠分別腹腔注射1.5%的冰乙酸0.2ml,觀察并記錄小鼠從注射冰乙酸后第一次出現(xiàn)扭體反應(yīng)(小鼠腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的時(shí)間(即扭體潛伏期)和注射15min內(nèi)小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)[4,5],并按下列公式計(jì)算扭體抑制率。

      扭體抑制率(%)=(空白對(duì)照組小鼠扭體次數(shù)-給藥組小鼠扭體次數(shù))/空白對(duì)照組小鼠扭體次數(shù)×100%

      2.5 雞蛋清致大鼠足腫脹法

      取SD大鼠72只,分組及給藥劑量見“1.4”,每日1次,連續(xù)灌胃7d,于末次給藥1h后,在大鼠右后足掌中心皮下注射10%雞蛋清生理鹽水溶液0.1ml造急性炎癥模型,分別在致炎前和致炎后0.5h、1h、2h測(cè)量并記錄各大鼠右后足趾固定位置的厚度,按下列公式計(jì)算足腫脹度[6]。

      足腫脹度(cm)=致炎后足趾厚度(cm)-致炎前足趾厚度(cm)

      2.6 二甲苯致小鼠耳腫脹法

      取小鼠80只,分組與給藥劑量見“1.4”,每日1次,連續(xù)灌胃7d,于末次給藥1h后,于小鼠左耳正反面均勻涂抹二甲苯0.05mL致炎,右耳不涂二甲苯。致炎0.5h后,將小鼠處死,剪下小鼠的左右兩耳,在左耳致炎的部位和右耳同一位置做好標(biāo)記,用打孔器在做好標(biāo)記的位置上打下圓耳片,隨即用電子天平精密稱量左右圓耳片的重量,記錄并計(jì)算小鼠耳廓腫脹度和腫脹度抑制率[7]。

      腫脹度(mg)=左耳重量(mg)-右耳重量(mg)

      腫脹抑制率(%)=(空白對(duì)照組小鼠耳腫脹度-給藥組小鼠耳腫脹度)/空白組小鼠耳腫脹度×100%

      2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      采用spss25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組與組之間的比較采用方差分析法處理。

      3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化赤瓟子提取工藝

      根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì),采用響應(yīng)面法確定出了蒙藥赤瓟子的浸膏提取率最高的條件,即最佳提取工藝為:液料比、乙醇的濃度、提取的時(shí)間、提取的溫度分別為15:1ml/g、68%、1h、80℃。

      3.2 對(duì)小鼠痛閾值的影響

      赤瓟子乙醇提取物對(duì)小鼠痛閾值的影響結(jié)果見表1。研究結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,CPZE中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的痛閾值隨著時(shí)間的推移顯著增加(P<0.01),而CPZE低劑量組和高劑量組小鼠的痛閾值顯著增加(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比,CPZE中劑量組小鼠的痛閾值差異具有顯著性(P<0.01),雖然CPZE比阿司匹林的鎮(zhèn)痛活性略低,但仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性。CPZE的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度與劑量呈一定相關(guān)性,即在一定范圍內(nèi),CPZE的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度隨著劑量的增加而增大。由表1可知,各組小鼠(空白對(duì)照組除外)痛閾值均在1.5h達(dá)到了峰值,換言之,1.5h CPZE的鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng),隨后各組小鼠痛閾值呈緩慢下降趨勢(shì)。

      3.3 對(duì)冰乙酸誘發(fā)小鼠疼痛的影響

      赤瓟子乙醇提取物對(duì)冰乙酸誘發(fā)小鼠疼痛的影響結(jié)果見表2。研究結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和CPZE高劑量組小鼠的扭體潛伏期延長(zhǎng)顯著(P<0.01),扭體次數(shù)顯著降低(P<0.05);CPZE中劑量組小鼠的扭體潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05),扭體次數(shù)顯著減少(P<0.05);CPZE低劑量組小鼠的扭體反應(yīng)潛伏期沒有明顯變化,但該組小鼠扭體次數(shù)降低較為顯著(P<0.05)。從各組(空白對(duì)照組除外)對(duì)冰乙酸誘發(fā)小鼠疼痛的抑制率來(lái)看,陽(yáng)性藥阿司匹林的抑制率最高,其扭體抑制率為61.86%,CPZE高劑量組、中劑量組的抑制率分別為55.37%和36.19%,CPZE低劑量組抑制率最低,抑制率只有19.43%,由此可知,鎮(zhèn)痛作用的強(qiáng)弱次序?yàn)椋喊⑺酒チ?gt;赤瓟子高劑量組>赤瓟子中劑量組>赤瓟子低劑量組。由表2可知,一方面,CPZE的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度隨著劑量的增加而逐漸增加,即呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性;另一方面,CPZE高劑量組的鎮(zhèn)痛作用與阿司匹林相比,雖然有差距,但并不大。

      3.4 對(duì)雞蛋清致大鼠足腫脹的影響

      赤瓟子乙醇提取物對(duì)雞蛋清致大鼠足腫脹的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。研究結(jié)果表明,與模型組相比,CPZE高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)大鼠足趾的局部炎癥均有顯著抑制作用(P<0.05/P<0.01),CPZE各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠足腫脹程度明顯降低(P<0.01),從0.5h以后均發(fā)揮了顯著的抗炎作用,且陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)大鼠炎癥的抑制活性最強(qiáng);與空白組相比,模型組大鼠足腫脹度增加明顯(P<0.01),從致炎0.5h后,各組大鼠足腫脹度均達(dá)到了峰值,隨后足腫脹度呈下降趨勢(shì);在0.5h、1h、2h CPZE各劑量組對(duì)大鼠足趾腫脹均有明顯的抑制作用(P<0.01),隨著劑量的增加,對(duì)炎癥的抑制作用越強(qiáng),即抗炎強(qiáng)度呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。

      3.5 對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

      赤瓟子乙醇提取物對(duì)二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響結(jié)果見表4。由表4可知,與空白對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和CPZE高劑量組小鼠的耳腫脹度顯著降低(P<0.01),CPZE中劑量組、低劑量組小鼠耳廓腫脹度變化也表現(xiàn)出明顯的差異性(P<0.05),表明陽(yáng)性對(duì)照藥和高劑量的CPZE能夠顯著緩解小鼠耳朵因涂二甲苯而引起的局部刺激性炎癥的癥狀,從而降低了小鼠的耳腫脹度。陽(yáng)性對(duì)照組、CPZE高劑量組小鼠的耳腫脹抑制率位居前兩位,分別為58.34%和54.76%,二者無(wú)明顯差距(P>0.05),這一結(jié)果不僅證明二者的抗炎活性較強(qiáng),而且作用強(qiáng)度也相差無(wú)幾,CPZE中劑量組和低劑量組的小鼠耳腫脹抑制率分別為27.85%和19.37%,低于CPZE高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組,二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示CPZE低劑量和中劑量小鼠的耳腫脹度雖有所下降,但不如阿司匹林和CPZE高劑量組,即抗炎活性遠(yuǎn)低于阿司匹林和CPZE高劑量組。

      4 討論

      熱板法和扭體法是用于評(píng)價(jià)藥物鎮(zhèn)痛活性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法,前者用于評(píng)價(jià)藥物的中樞鎮(zhèn)痛活性,后者用于評(píng)價(jià)藥物的外周鎮(zhèn)痛活性[8]。熱板法系利用一定強(qiáng)度的溫?zé)岽碳ば∈竽骋徊课划a(chǎn)生痛反應(yīng),熱刺激強(qiáng)度使皮溫度升高至45~55℃,低于45℃不會(huì)產(chǎn)生明顯痛覺,高于55℃會(huì)灼傷小鼠,因此控制好熱板溫度是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。扭體法系將一定體積和濃度的化學(xué)刺激性物質(zhì)注入小鼠腹腔內(nèi),刺激臟層和壁層腹膜,引起深部較大面積較長(zhǎng)時(shí)間的疼痛,該反應(yīng)在注射15min內(nèi)出現(xiàn)頻率高,該法缺點(diǎn)是缺乏一定特異性,因此必須輔助其他鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)進(jìn)行佐證[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熱板法和扭體法互相佐證、互為補(bǔ)充,使用兩種實(shí)驗(yàn)方法不僅避免了單一實(shí)驗(yàn)方法出現(xiàn)的缺陷和誤差,還能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛活性。

      小鼠耳腫脹法和大鼠足腫脹法作為篩選新抗炎藥物的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法,具有操作簡(jiǎn)單、方法可靠、差異性小、重現(xiàn)性高的特點(diǎn)。小鼠耳腫脹法的操作難點(diǎn)在于涂二甲苯的部位與取下的耳片要相吻合,否則會(huì)產(chǎn)生較大偏差,大鼠足腫脹法的操作難點(diǎn)在于足腫脹厚度的測(cè)定,為避免出現(xiàn)較大誤差,打耳片時(shí)提前在相應(yīng)位置做好標(biāo)記,測(cè)足腫脹厚度時(shí)采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺,保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

      蒙藥赤瓟子作為常用民族藥,在少數(shù)民族地區(qū)應(yīng)用廣泛,其化學(xué)成分復(fù)雜,藥理活性多樣。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,赤瓟子的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、皂苷、有機(jī)酸、香豆素、鞣質(zhì)等[9,10],赤瓟子不僅有鎮(zhèn)痛抗炎活性,還具有抑菌、解熱、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[11],因此赤瓟子具有較大的藥用價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景。目前,赤瓟子的用法用量主要依據(jù)典籍的記載和醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn),由于缺乏有效的數(shù)據(jù)支撐,用藥的安全性、有效性不能得到保證,這也限制了藥物的開發(fā)和應(yīng)用。本研究證明CPZE在體內(nèi)具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎活性,但CPZE的毒性、體外活性及作用機(jī)制尚未探明,這對(duì)全面推進(jìn)赤瓟子的現(xiàn)代化進(jìn)程至關(guān)重要,后續(xù)的研究將為蒙藥赤瓟子的臨床合理應(yīng)用和藥物的開發(fā)利用提供更詳細(xì)、更全面、更科學(xué)的參考依據(jù)。

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