吳 限,張 磊,王 悅
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院針灸科,哈爾濱 150040)
發(fā)熱是一種常見(jiàn)的疾病,新型冠狀病毒肺炎以發(fā)熱為主要癥狀之一。目前,西醫(yī)主要使用口服或注射退燒藥、抗生素治療發(fā)熱[1],中醫(yī)通過(guò)針刺特定穴位治療發(fā)熱,具有廉價(jià)、便捷、見(jiàn)效快等優(yōu)勢(shì)。大椎在人體第7 頸椎棘突下凹陷中,主治外感熱病,是針灸治療發(fā)熱的要穴,退熱作用明顯[2-4]。前列腺素E2(PGE2)是公認(rèn)的發(fā)熱過(guò)程中的重要脂質(zhì)介質(zhì)之一[5]。關(guān)于大椎退熱的最佳針刺時(shí)機(jī)尚無(wú)系統(tǒng)研究,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在不同時(shí)機(jī)針刺大椎對(duì)發(fā)熱大鼠體溫和下丘腦PGE2 含量變化的影響,探求大椎退熱的最佳針刺時(shí)機(jī)及退熱作用機(jī)制,報(bào)道如下。
SPF 級(jí)SD 大鼠450 只,由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供,許可證編號(hào):SCXK(遼)2020-0001。
干酵母粉(安琪酵母股份有限公司,生產(chǎn)許可證編號(hào):420528010005);前列腺素E2(PGE2)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 試劑盒(聯(lián)科,貨號(hào):EK8103);華佗牌一次性針灸針,規(guī)格0.30 mm×13 mm(蘇州醫(yī)療用品長(zhǎng)有限公司);電子天平,LS-T302(蘭思儀器有限公司);電子體溫計(jì),DT-101A(廣東天際電器有限公司)
1.3.1 建模 將450 只SD 大鼠(雌雄各半)飼養(yǎng)于(24±1)℃、(55±10)%相對(duì)濕度和12 h 明暗循環(huán)的房間中,提供充足食物與飲用水源,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,每日測(cè)量肛溫3 次,單次體溫高于38℃或3 次肛溫波動(dòng)大于0.3℃者淘汰。實(shí)驗(yàn)前10 h 禁食,可自由飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日,每只大鼠測(cè)量肛溫3 次,每次間隔0.5 h,取3 次肛溫平均值為大鼠基礎(chǔ)體溫。隨機(jī)選取10 只作為空白對(duì)照組(標(biāo)記為A),剩余大鼠進(jìn)行建模:背部皮下注射20% 酵母懸液10 mL·kg-1,注射后按壓注射部位1 min 以防液體外滲,建立大鼠發(fā)熱模型。建模后每小時(shí)測(cè)量肛溫1 次,共測(cè)量4 次。4 h 后大鼠體溫較基礎(chǔ)體溫升高0.8℃以上者視為造模成功。
1.3.2 分組設(shè)置 根據(jù)對(duì)常用大鼠發(fā)熱模型的研究[6-7],SD 大鼠在皮下注射20%干酵母懸液后,體溫會(huì)在經(jīng)歷短時(shí)間的下降后迅速上升,于6 ~7 h到達(dá)體溫峰值并進(jìn)入峰值平臺(tái)期,10 h 時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)峰值。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此設(shè)置4 個(gè)治療組,分別選擇以大鼠發(fā)熱的體溫上升期、體溫到達(dá)波峰前1h、體溫到達(dá)波峰時(shí)、峰值平臺(tái)期作為針刺時(shí)機(jī)。將成功建模的大鼠隨機(jī)分為B ~G 組。
A 組:空白對(duì)照組(10 只),正常飼養(yǎng),不做任何處理;B 組:模型對(duì)照組(90 只),建模成功后正常飼養(yǎng);C 組:治療1 組(90 只),建模成功后即刻針刺大椎;D 組:治療2 組(80 只),建模成功后1 h 針刺大椎;E 組:治療3 組(70 只),建模成功后2 h 針刺大椎;F 組:治療4 組(60 只),建模成功后3 h 針刺大椎;G 組:非經(jīng)非穴組(10只),建模成功后即刻針刺大椎旁開(kāi)0.5 cm 處。
1.3.3 取穴與針刺方法 1)取穴:參照《常用動(dòng)物針灸穴位圖譜》,同時(shí)結(jié)合模擬人體經(jīng)穴并比較解剖學(xué)方法選取大椎:第7 頸椎與第1 胸椎間,背部正中。2)針刺方法:選取大椎,針尖向上斜刺0.3 cm,留針30 min,每15 min 行針1 次。行針時(shí)用捻轉(zhuǎn)瀉法:大拇指作用力向后時(shí)用力捻轉(zhuǎn),然后輕力向前退回,捻轉(zhuǎn)幅度360°,頻率每分鐘60 次,持續(xù)捻針l min。
1.3.4 數(shù)據(jù)測(cè)量 各組在建模成功后0.5 ~9 h,每0.5 h 隨機(jī)挑選5 只大鼠進(jìn)行肛溫測(cè)量。A 組最后1個(gè)時(shí)間點(diǎn)和B 組所有時(shí)間點(diǎn)和C ~F 組針刺后所有時(shí)間點(diǎn)所取的大鼠,在測(cè)量肛溫后斷頭處死,取下丘腦液氮速凍,-80 ℃凍存。下丘腦PGE3 含量測(cè)定:提取實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織的樣本,加入生理鹽水,制成10% 腦勻漿,離心,分離取上清液,-20℃ 冰箱保存待測(cè)。按照檢測(cè)說(shuō)明書(shū),采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)法測(cè)定大鼠腦組織上清液中的PGE2 含量。
觀察各組體溫與PGE2 含量變化情況,比較各組退熱起效時(shí)間和解熱時(shí)間:退熱起效時(shí)間為針刺治療開(kāi)始后到體溫下降0.5℃以上所需時(shí)間,解熱時(shí)間為從針刺大椎治療開(kāi)始到體溫下降到正常范圍所需時(shí)間。
采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組內(nèi)比較用重復(fù)測(cè)量資料方差分析;組間比較用單因素方差分析;兩變量間的關(guān)系用相關(guān)性分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
大鼠在注射20%酵母懸液后出現(xiàn)短暫的四肢及口唇蒼白,后隨體溫上升而逐漸出現(xiàn)蜷縮和四肢、口唇、耳部的發(fā)紅發(fā)燙,至體溫顯著升高時(shí)出現(xiàn)呼吸急促、豎毛、肢體末端深紅發(fā)燙。治療組進(jìn)行針刺治療后,大鼠各種發(fā)熱體征均有明顯減弱,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)已基本恢復(fù)至正常狀態(tài)。
模型對(duì)照組在注射20% 酵母懸液6 h 后到達(dá)體溫峰值并進(jìn)入平臺(tái)期,注射后10 h 出現(xiàn)第2 個(gè)峰值,與預(yù)期的大鼠發(fā)熱模型相符。各治療組在針刺大椎穴治療后均對(duì)大鼠體溫產(chǎn)生了不同程度的影響。除空白對(duì)照組外,各組建模成功時(shí)體溫與基礎(chǔ)體溫比較均顯著升高(P<0.05),提示建模成功。見(jiàn)表1。
表1 各組建模后大鼠體溫比較(±s ,n= 5) ℃
注:與A 組比較,# P <0.05;與B 組比較,△P <0.05
組別 基礎(chǔ)體溫 建模成功時(shí) 建模1.0 h建模1.5 h建模2.5 h建模3.5 h建模5.0 h建模7.0 h建模8.0 h A 組37.32±0.06 37.32±0.06 37.32±0.09 37.32±0.06 37.33±0.08 37.32±0.08 37.32±0.06 37.32±0.06 37.31±0.07 B 組37.34±0.08 38.52±0.13# 38.98±0.11# 39.30±0.12# 39.53±0.11# 39.39±0.11# 39.34±0.11# 39.17±0.08# 38.91±0.11#C 組37.34±0.10 38.44±0.15△38.68±0.11△38.81±0.17△38.79±0.16△38.61±0.13△38.59±0.11△38.08±0.16△37.43±0.14△D 組37.30±0.09 38.47±0.14△38.98±0.17△39.05±0.16△38.91±0.12△38.44±0.15△37.72±0.14△37.34±0.10△37.31±0.09△E 組 37.35±0.10 38.50±0.12△38.97±0.15△39.29±0.20△39.06±0.19△38.20±0.22△37.36±0.10△37.37±0.11△37.35±0.12△F 組 37.34±0.11 38.47±0.16△39.02±0.15△39.34±0.15△39.53±0.17△38.98±0.11△38.31±0.11△37.37±0.12△37.35±0.11△G 組37.36±0.07 38.51±0.10△38.98±0.10△39.32±0.12△39.50±0.10△39.39±0.11△39.38±0.07△39.20±0.11△38.84±0.07△
與空白對(duì)照組進(jìn)行比較:治療1 組在建模8.0 h及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),治療2 組在建模7.0 h 及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),治療3 組在建模5.0 h 及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),治療4 組在建模7.0 h 及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示治療組均可使發(fā)熱大鼠體溫降至正常水平,各組解熱時(shí)間:治療3 組(3 h)<治療4 組(4 h)<治療2 組(6 h)<治療1 組(8 h)。
與模型對(duì)照組進(jìn)行比較:治療1 組體溫從建模1.0 h,即治療1.0 h開(kāi)始均低于模型對(duì)照組,治療2組、治療3 組、治療4 組體溫分別從建模1.5 h、建模2.5 h、建模3.5 h,即每組治療0.5 h 開(kāi)始低于模型對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),非經(jīng)非穴組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示4 個(gè)治療組均具有抑制發(fā)熱大鼠體溫升高的作用,治療1 組的抑制作用要慢于其他組,非經(jīng)非穴組無(wú)抑制作用。
治療組體溫變化趨勢(shì):治療1 組體溫在針刺治療后仍然處于上升趨勢(shì),于治療2.0 h 后到達(dá)峰值并進(jìn)入1 個(gè)類(lèi)似模型對(duì)照組的峰值平臺(tái)期,于治療6.0 h出現(xiàn)第2 個(gè)峰值,在此期間始終顯著高于治療開(kāi)始時(shí)體溫(P<0.05),從治療6.5 h 起低于治療開(kāi)始時(shí)體溫并持續(xù)降低至正常水平(P<0.05):治療2組體溫在治療后先上升1.0 h 到達(dá)峰值,后持續(xù)降低,在治療2.0 h 及之后顯著低于治療開(kāi)始時(shí)體溫(P<0.05),在治療5.0 h 出現(xiàn)1 個(gè)回升的小波峰,之后降至正常體溫;治療3 組和治療4 組體溫從治療0.5 h 起持續(xù)降低至正常水平,并顯著低于治療開(kāi)始時(shí)體溫(P<0.05),其中治療3 組在0.5 h 的體溫降低值已超過(guò)0.5℃,達(dá)到退熱起效時(shí)間標(biāo)準(zhǔn),治療4 組未達(dá)到。因此退熱起效時(shí)間治療3 組<治療4組<治療2 組<治療1 組。見(jiàn)表2。
表2 各組大鼠治療后體溫比較(±s ,n= 5) ℃
表2 各組大鼠治療后體溫比較(±s ,n= 5) ℃
注:與A 組比較,# P <0.05
組別 治療開(kāi)始時(shí)治療0.5h治療1.0 h治療2.0 h治療5.0 h治療6.0 h治療6.5 h A 組 37.32±0.0637.31±0.0837.32±0.0937.31±0.0637.32±0.0637.32±0.0637.30±0.05 C 組 38.44±0.1538.54±0.12#38.68±0.11#38.87±0.16#38.59±0.11#38.69±0.11#38.39±0.14#D 組 38.98±0.1739.05±0.16#39.11±0.13#38.71±0.12#37.70±0.16#37.34±0.10#37.30±0.09#E 組39.57±0.1939.06±0.19#38.64±0.18#37.83±0.17#37.37±0.11#37.35±0.12#37.36±0.11#F 組39.40±0.1338.98±0.11#38.73±0.11#38.31±0.11#37.35±0.11#37.34±0.14#
治療1 組PGE2 含量從建模1.0 h 起始終低于模型對(duì)照組(P<0.05),于建模8.0 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);治療2 組PGE2 含量從建模2.0 h 起始終低于模型對(duì)照組(P<0.05),于建模7 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);治療3 組PGE2 含量從建模2.5 h 起始終低于模型對(duì)照組(P<0.05),于建模5 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);治療4 組PGE2 含量從建模3.5 h 起始終低于模型對(duì)照組(P<0.05),于建模7 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示治療組均可抑制發(fā)熱大鼠下丘腦PGE2 的升高,并降至正常水平,與大鼠體溫的變化趨勢(shì)相似。見(jiàn)表3。
表3 建模后大鼠下丘腦PGE2 含量變化比較(±s ,n= 5) pg ·mgprot-1
表3 建模后大鼠下丘腦PGE2 含量變化比較(±s ,n= 5) pg ·mgprot-1
注:與B 組比較,# P <0.05
組別建模1.0 h建模2.0 h建模2.5 h建模3.5 h建模5.0 h建模7.0 h建模8.0 h B 組60.42±5.1370.92±4.5968.94±3.4767.64±4.6865.00±4.6167.78±4.0656.71±4.02 C 組48.17±4.67#55.42±4.48#53.87±4.27#50.52±4.39#46.78±4.01#47.59±4.57#34.09±3.93#D 組62.78±4.68#55.60±4.61#48.29±5.98#41.67±3.21#35.47±5.42#29.90±4.41#E 組56.61±5.05#42.45±3.84#35.98±5.73#29.55±5.21#31.42±5.04#F 組58.82±4.52#49.12±6.13#36.08±4.88#31.18±3.60#
為進(jìn)一步探求體溫與PGE2 含量之間的關(guān)系,選擇數(shù)據(jù)完整的C 組建模后體溫與對(duì)應(yīng)PGE2 進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),R2= 0.842 8,見(jiàn)圖1。提示發(fā)熱大鼠體溫與下丘腦PGE2 含量具有十分顯著的正相關(guān)關(guān)系。
圖1 建模后C 組大鼠體溫與下丘腦中PGE2 散點(diǎn)圖分析
外感發(fā)熱為中醫(yī)常見(jiàn)病癥,因感受六淫之邪或疫癘之氣,臟腑功能失調(diào)、陰陽(yáng)失衡而致病,又稱(chēng)“發(fā)熱”“寒熱”“壯熱”[8]。干酵母致熱大鼠其體溫先短暫下降,而后迅速上升至峰值并進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的峰值平臺(tái)期的特征,符合中醫(yī)邪襲衛(wèi)表證和氣分熱證的病理機(jī)制[9],因此本實(shí)驗(yàn)選擇干酵母致熱大鼠作為研究對(duì)象,根據(jù)其發(fā)熱階段進(jìn)行分組,以實(shí)現(xiàn)在不同時(shí)機(jī)對(duì)大椎進(jìn)行針刺治療觀察發(fā)熱大鼠的體溫變化。
針刺對(duì)發(fā)熱具有良好的治療作用[10-12],大椎是治療發(fā)熱的要穴。大椎始見(jiàn)于《素問(wèn)·骨空論篇》,為人體督脈穴,也是手足三陽(yáng)經(jīng)的交會(huì)穴,居上屬陽(yáng),有向上向外之性,有振奮陽(yáng)氣之作用,因此針刺大椎有調(diào)節(jié)全身陽(yáng)氣,解表退熱的作用[13]。本研究結(jié)果表明,無(wú)論在哪個(gè)階段對(duì)大椎穴進(jìn)行針刺治療均可起到抑制發(fā)熱作用,并解熱至大鼠正常體溫,充分證實(shí)了大椎穴其良好的退熱作用,也與近些年來(lái)對(duì)大椎穴退熱效應(yīng)的研究成果相符[14-16]。非經(jīng)非穴組并無(wú)抑制大鼠發(fā)熱的作用,驗(yàn)證了穴位特異性的存在。穴位特異性是指不同穴位對(duì)機(jī)體的治療具有不同的特異效應(yīng),是針灸選穴基本原則之一,對(duì)穴位特異性進(jìn)行的相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)研究亦證明了此特性的存在[17-18]。通過(guò)對(duì)4 個(gè)治療組大鼠體溫變化的分析可知:治療組均可抑制發(fā)熱大鼠下丘腦PGE2升高,并降至正常水平,與大鼠體溫的變化趨勢(shì)相似。
本實(shí)驗(yàn)中各治療組均可抑制發(fā)熱大鼠下丘腦中PGE2 含量升高,并使其降至正常水平,與對(duì)大鼠體溫的抑制作用相似。為進(jìn)一步探求體溫與PGE2含量之間的關(guān)系,選擇了數(shù)據(jù)完整的C 組建模后體溫與對(duì)應(yīng)PGE2 進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示體溫與PGE2 含量成明顯正相關(guān),即體溫隨PGE2 含量的升高而上升,隨其降低而下降(R2= 0.842 8),提示建模后不同時(shí)間的發(fā)熱大鼠體溫與下丘腦PGE2 含量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此可推斷不同時(shí)間對(duì)發(fā)熱大鼠大椎行針刺后的退熱機(jī)制可能是通過(guò)降低包括PGE2在內(nèi)的中樞性發(fā)熱介質(zhì)的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
《素問(wèn)·針解篇》[19]曰:“補(bǔ)瀉之時(shí)者,與氣開(kāi)闔相合也?!奔匆罁?jù)氣血盛衰來(lái)進(jìn)行針刺補(bǔ)瀉。氣血迎時(shí)為盛,去時(shí)為衰,本實(shí)驗(yàn)中大鼠體溫到達(dá)波峰時(shí)乃氣血最盛之時(shí),根據(jù)子午流注法“逢時(shí)而刺”“瀉則乘其盛”思想,此時(shí)進(jìn)行大椎的瀉法針刺療效顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討大椎退熱機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ),并為科學(xué)解釋子午流注針?lè)ㄌ峁┝怂悸放c啟發(fā)。
綜上所述,在不同時(shí)機(jī)針刺發(fā)熱大鼠大椎穴均有退熱療效,可使大鼠體溫恢復(fù)正常,以體溫到達(dá)峰值時(shí)進(jìn)行針刺退熱效果最佳。針刺退熱具有穴位特異性。針刺發(fā)熱大鼠大椎可能是通過(guò)抑制PGE2等內(nèi)源性脂類(lèi)介質(zhì)的釋放實(shí)現(xiàn)退熱機(jī)制。