高圣風(fēng), 付華菲, 海 龍, 茍亞峰, 孫世偉,劉世超, 薛 超, 田 甜, 溫思為

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 香料飲料研究所 海南 萬(wàn)寧 571533；2.海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南 萬(wàn)寧 571533；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院 云南 普洱 665000)

1 材料與方法

胡椒Piper nigrumL.屬胡椒科Piperaceae 胡椒屬Piper多年生常綠藤本植物，是世界上使用最廣泛的香料之一，被譽(yù)為“香料之王”[1]。胡椒瘟病具有極強(qiáng)的毀滅性和傳播性，于20 世紀(jì)70 年代曾在海南省爆發(fā)流行，導(dǎo)致種植面積縮減20%[1]，是危害胡椒生產(chǎn)的首要病害。但是胡椒瘟病的病原菌物種分類(lèi)尚存爭(zhēng)議，這不利于其機(jī)理研究和防控工作的開(kāi)展。

胡椒瘟病是世界性病害。在國(guó)外，胡椒瘟病菌最初因?yàn)槠涿倒寤ò隊(duì)罹湫螒B(tài)被認(rèn)為是棕櫚疫霉Phytophthora palmivora[2]，后來(lái)發(fā)現(xiàn)，馬來(lái)西亞胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子囊形態(tài)更接近于當(dāng)?shù)氐睦苯芬呙筆.capsici[3]。在國(guó)內(nèi)，張開(kāi)明等[4]根據(jù)孢子囊特征認(rèn)為中國(guó)華南地區(qū)胡椒瘟病的病原菌有2 種，辣椒疫霉和寄生疫霉P.parasitica；桑利偉等[5]調(diào)研海南省胡椒病害時(shí)發(fā)現(xiàn)，胡椒瘟病菌孢子囊形態(tài)特征與辣椒疫霉一致，且內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列與辣椒疫霉菌株同源性最高。

辣椒疫霉寄主范圍非常廣泛，已知寄主多達(dá)50 余種作物，包括：辣椒、番茄、茄子等茄科植物，黃瓜、南瓜、西瓜等葫蘆科植物，白菜、菜花、胡蘿卜等十字花科植物，菜豆、豇豆等豆科植物，以及胡椒、橡膠樹(shù)、木瓜、可可等熱帶經(jīng)濟(jì)作物，等等[6-8]。目前關(guān)于辣椒疫霉致病研究主要集中在辣椒、南瓜等溫帶瓜菜類(lèi)作物上，在熱帶香料作物胡椒上報(bào)道極少。而且有研究表明，分離自胡椒上的辣椒疫霉菌在遺傳學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與溫帶茄科、葫蘆科等作物上的辣椒疫霉菌分屬不同的分類(lèi)亞群[9]。海南島地處獨(dú)特的熱帶島嶼環(huán)境，其病原菌普遍存在地域特異性。分析卵菌殺菌劑對(duì)胡椒瘟病菌的室內(nèi)毒力，對(duì)認(rèn)識(shí)和針對(duì)性地防控海南島辣椒疫霉病害具有指導(dǎo)意義。

本研究采用生物形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合方法，對(duì)我國(guó)胡椒主產(chǎn)區(qū)海南省萬(wàn)寧市興隆鎮(zhèn)和南橋鎮(zhèn)的胡椒瘟病樣本進(jìn)行分離鑒定，并分析我國(guó)當(dāng)前在農(nóng)作物疫病上登記使用的20 種卵菌殺菌劑原藥對(duì)胡椒瘟病菌的室內(nèi)毒力，以期明確當(dāng)前主產(chǎn)區(qū)胡椒瘟病病原菌種類(lèi)及其藥劑敏感性，為胡椒生產(chǎn)上殺菌劑針對(duì)性使用奠定基礎(chǔ)。

1.1 供試材料

1.1.1 病原菌培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[10]：馬鈴薯200g 洗凈切成邊長(zhǎng)約1cm 的方塊，放入1000mL 去離子水中煮沸15min，雙層紗布過(guò)濾，濾液中加入葡萄糖和瓊脂粉各20g，溶解后用去離子水定容至1000mL，分裝至三角瓶中，50mL/瓶，封口后用121℃高壓蒸汽滅菌20min，于4℃保存。

10%V8 蔬菜汁(V8)培養(yǎng)基[11]：離心去渣的V8蔬菜汁100mL、CaCO31g、瓊脂粉20g，用去離子水定容至1000mL，121℃滅菌20min，于4℃保存。

1.1.2 卵菌殺菌劑原藥 在中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.chinapesticide.org.cn)查詢當(dāng)前農(nóng)作物卵菌病害上登記使用的農(nóng)藥種類(lèi)并統(tǒng)計(jì)其有效成分，購(gòu)置分析純或更高純度的原藥20 種，藥劑名稱及CAS 號(hào)見(jiàn)表1。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行保藏和使用。

表1 供試卵菌殺菌劑及系列稀釋質(zhì)量濃度Table 1 Series dilution concentrations of the fungicides tested in this study

1.2 研究方法

1.2.1 胡椒瘟病菌的分離純化 分離純化：胡椒瘟病感病葉片樣本采集自海南省萬(wàn)寧市興隆鎮(zhèn)(18°44′0″N；110°11′40″E)和南橋鎮(zhèn)(18°41′43″N；110°10′26″E)。在超凈工作臺(tái)中剪取病斑病健交界處放入75% 酒精中浸泡30s，用無(wú)菌水清洗3 次，晾干后剪成邊長(zhǎng)約0.5cm 的小塊，放置在PDA 平板上，26℃恒溫培養(yǎng)24h；從長(zhǎng)出的菌落邊緣挑取菌絲塊轉(zhuǎn)接至新PDA 平板上并繼續(xù)培養(yǎng)24h，重復(fù)轉(zhuǎn)接純化3 次。

回接驗(yàn)證：用無(wú)菌打孔器將純化好的菌落打成直徑約0.5cm 的菌絲塊。在離體胡椒葉片中央用無(wú)菌大頭針刺3 個(gè)小孔，并將菌絲塊覆蓋在針孔上，菌絲面與葉片接觸，26℃恒溫培養(yǎng)72h 后觀察發(fā)病情況。

菌種保存：將通過(guò)驗(yàn)證的病原菌轉(zhuǎn)接至PDA 試管斜面，14℃恒溫保存。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 將活化好的胡椒瘟病菌接種至V8 培養(yǎng)基上，用錫紙包裹避光，26℃黑暗培養(yǎng)5 d。于超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌玻璃棒輕輕抹壓，使氣生菌絲貼附在培養(yǎng)基表面，在26 ℃、5000 lx 恒溫光照條件下培養(yǎng)36 h，誘導(dǎo)孢子囊形成。向平板中加入10 mL 無(wú)菌水，先于4 ℃冷藏1 h，再于30 ℃恒溫放置30 min，促使游動(dòng)孢子釋放。吸取孢子懸浮液，制作臨時(shí)裝片，用光學(xué)顯微鏡觀察游動(dòng)孢子[10-11]。

1.2.3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析 提取病原菌DNA并采用核糖體DNA 的ITS擴(kuò)增通用引物(ITS1 和ITS4)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序。以GenBank下載的已鑒定菌株序列為參考，通過(guò)CLUSTALX2.1軟件進(jìn)行序列兩兩多重比較分析，通過(guò)MEGA7軟件采用Neighbor-joining計(jì)算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并用Bootstrap(1000 次重復(fù))檢驗(yàn)聚類(lèi)分支自舉支持率[12]。

1.2.4 供試卵菌殺菌劑對(duì)胡椒瘟病菌的室內(nèi)活性分析 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[13]測(cè)定供試20 種卵菌殺菌劑原藥對(duì)胡椒瘟病菌的室內(nèi)毒力。在無(wú)菌條件下，用二甲基亞砜將供試藥劑溶解，稀釋成系列質(zhì)量濃度的藥液供試。藥液的每一步操作均須在渦旋20s 后立即用移液槍吸取添加。將50mLPDA 培養(yǎng)基融化后冷卻至50 ℃左右，加入藥液混勻后等量倒入3 個(gè)直徑9 cm 的平板中，制成系列質(zhì)量濃度的PDA 含藥平板，濃度梯度見(jiàn)表1。用無(wú)菌打孔器將培養(yǎng)5 d 的菌落打成直徑約0.5 cm的菌絲塊，菌絲面朝下接種至PDA 平板中央，于26 ℃下培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。以不含藥PDA 平板為對(duì)照，每處理3 個(gè)重復(fù)。按公式 (1) 計(jì)算各濃度殺菌劑對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

式中：I為菌絲生長(zhǎng)抑制率，%；D0為對(duì)照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)IBM SPSS statistics 22 軟件采用Probit 回歸模型分析抑菌率與藥劑濃度 (以10 為底的對(duì)數(shù))的線性關(guān)系，計(jì)算毒力回歸方程并進(jìn)行皮爾遜擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算出EC50值及其95%置信區(qū)間 (confidence interval, CI)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將從田間樣本分離的7 個(gè)菌株回接至胡椒葉片，發(fā)現(xiàn)3 株可引起胡椒瘟病典型癥狀，葉斑黑色，近圓形，直徑約1.5～3.5 cm，邊緣不光滑、有布料線頭狀毛邊 (圖1A、1B)。3 個(gè)菌株的菌落形態(tài)十分相似，均在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)生帶有放射狀紋理的圓形菌落，氣生菌絲較短、白色 (圖1C)。在光學(xué)顯微鏡下，3 株病原菌的形態(tài)也無(wú)明顯差異，均能在V8 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生洋梨形孢子囊，并釋放出圓形游動(dòng)孢子；但是不同培養(yǎng)批次的孢子囊的長(zhǎng)寬比存在差異 (圖1D、1E)。其菌落和微觀形態(tài)與前人報(bào)道的中國(guó)溫帶地區(qū)的辣椒疫霉P.capsici一致[1,5]；但是不同于印度尼西亞的胡椒瘟病菌[2]。

圖1 胡椒瘟病癥狀及其病原菌形態(tài)Fig.1 Disease symptom and pathogen morphology of black pepper foot rot disease

2.2 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)3 株病原菌的ITS 測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)菌株的ITS 片段序列片完全一致，擇一上傳至GenBank，登錄號(hào)為OQ608808。通過(guò)BLAST 比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其ITS 基因序列與辣椒疫霉的同源性為100%。從GenBank 下載3 株辣椒疫霉和9 種其他疫霉菌的ITS 序列：P.capsica(MH842159.1、KY575676.1、MT678677.1)、P.c i t r o p h t h o r a(K U 9 3 4 2 1 0.1)、P.m e a d i i(JX155793.1)、P.megasperma(KJ405942.1)、P.sojae(AY590272.1)、P.palmivora(JX155791.1)、P.cactorum(KM085441.1)、P.parasitica(GU111674.1)、P.i n f e s t a n s(G U 2 5 8 1 5 1.1)、P.h e v e a e(EU045747.1)。以煙草霜霉菌 (Peronosporatabacina，DQ067899.1) 為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)本研究菌株與分離自國(guó)內(nèi)外的3 株辣椒疫霉菌聚類(lèi)在同一分支，自舉支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，判定本研究從胡椒上分離的菌株為辣椒疫霉(圖2)。

圖2 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建辣椒疫霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Phytophthora capsica based on rDNA-ITS sequences

2.3 供試卵菌殺菌劑對(duì)胡椒瘟病菌的室內(nèi)殺菌活性分析

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法計(jì)算出20 種供試卵菌殺菌劑對(duì)胡椒瘟病菌的毒力回歸方程和EC50值 (表2)，其中多抗霉素因抑菌很差未進(jìn)行毒力分析。通過(guò)皮爾遜卡方檢驗(yàn)零假設(shè)模型分析發(fā)現(xiàn)，顯著性Sig 值均大于0.150，說(shuō)明毒力回歸模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合度較好。按EC50值升序排列，吡唑醚菌酯、氟啶胺、福美雙、烯酰嗎啉、氰霜唑、甲霜靈等6 種藥劑的EC50< 1 μg/mL，抑制菌絲生長(zhǎng)效果最好；喹啉銅、百菌清、代森錳鋅、代森鋅、氫氧化銅等6 種藥劑的EC50值處于1～10 μg/mL 之間，抑菌效果較好；氧化亞銅、王銅、嘧菌酯、香芹酚、霜脲氰、小檗堿等6 種藥劑的EC50值處于10～50 μg/mL 之間，抑菌效果一般；幾丁聚糖、三乙膦酸鋁的EC50> 300 μg/mL，抑菌效果較差。

表2 供試20 種卵菌殺菌劑對(duì)胡椒瘟病菌的殺菌活性Table 2 Inhibitory activity of 20 oomycete fungicides against P.capsici causing black pepper foot rot disease

3 結(jié)論與討論

本研究將海南萬(wàn)寧胡椒主產(chǎn)區(qū)的胡椒瘟病病原菌鑒定為辣椒疫霉P.capsici，發(fā)現(xiàn)菌落及孢子囊等形態(tài)特征受菌株特異性和環(huán)境因素影響較大，僅能作為物種判定的參考[15]，ITS 序列等分子鑒定手段更容易區(qū)分形態(tài)相近的辣椒疫霉、棕櫚疫霉及寄生疫霉[1,5]。同時(shí)評(píng)價(jià)了20 種我國(guó)當(dāng)前在農(nóng)作物疫病上登記使用的卵菌殺菌劑原藥對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯、氟啶胺、福美雙、烯酰嗎啉、氰霜唑及甲霜靈的室內(nèi)毒力最高，其中吡唑醚菌酯、甲霜靈和嘧菌酯等藥劑的抑菌結(jié)果不同于其對(duì)溫帶辣椒疫霉上的報(bào)道[13,16-18]，推測(cè)與海南島胡椒瘟病菌的地域特異性有關(guān)。

本研究中，胡椒瘟病菌在PDA 平板上的菌落紋理為放射狀 (圖1C)，與桑利偉等[5]報(bào)道的胡椒瘟病菌一致，但不同于Muller[2]報(bào)道的印度尼西亞胡椒瘟病菌，有著與棕櫚疫霉一致的玫瑰花瓣?duì)罴y理。Truong 等[15]將越南全境的204 株胡椒瘟病菌鑒定為辣椒疫霉，但是發(fā)現(xiàn)其在PDA 上的菌落紋理存在放射狀、玫瑰花瓣?duì)?、棉絨狀等眾多形態(tài)，因此推測(cè)胡椒瘟病菌的菌落紋理可能存在地域性差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，同一株胡椒瘟病菌不同觀察批次孢子囊的長(zhǎng)寬比差別很大，孢子囊形狀有時(shí)較為狹長(zhǎng)、有時(shí)略顯粗短 (圖1D、1E)，推測(cè)顯微視野中的孢子囊長(zhǎng)寬比可能與其生長(zhǎng)狀態(tài)或觀察角度有關(guān)。由此推測(cè)，張開(kāi)明等[4]以孢子囊長(zhǎng)寬比為主要參考依據(jù)，將胡椒瘟病菌鑒定分為辣椒疫霉和寄生疫霉兩類(lèi)，可能不夠精準(zhǔn)。通過(guò)ITS 序列分析，本研究中的胡椒瘟病菌與國(guó)內(nèi)外辣椒疫霉菌聚類(lèi)到同一分支，自舉支持率達(dá)100%，這與桑利偉等[5]和Truong 等[15]的報(bào)道一致，說(shuō)明形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS 序列，能夠有效區(qū)分胡椒瘟病菌與棕櫚疫霉、寄生疫霉等形態(tài)相近的病原菌。

嘧菌酯在國(guó)際殺菌劑市場(chǎng)中占據(jù)巨大份額，何烈干等[13]發(fā)現(xiàn)，江西省58 株番茄綿疫病菌P.capsici對(duì)嘧菌酯 (96%純度，先正達(dá) (蘇州) 作物保護(hù)有限公司) 的EC50值介于0.1867～1.6239 μg/mL之間，抗藥性風(fēng)險(xiǎn)中等；但在本研究中，嘧菌酯(98%純度，上海源葉生物科技有限公司) 對(duì)海南胡椒瘟病的EC50值高達(dá)28.23 μg/mL；而同屬于甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的吡唑醚菌酯的抑菌活性最高，EC50值僅為0.02 μg/mL，甚至低于烯酰嗎啉 (0.12 μg/mL)。不同于孫平平等[16]、苗建強(qiáng)等[17]報(bào)道的烯酰嗎啉對(duì)溫帶辣椒疫霉菌絲抑制活性比吡唑醚菌酯高10 倍左右。而氟啶胺在本研究中的抑菌活性 (EC50值為0.07 μg/mL) 高于氰霜唑(EC50值為0.36 μg/mL)，與楊叔青等[18]報(bào)道的氟啶胺對(duì)溫帶辣椒疫霉的測(cè)定結(jié)果一致，并未表現(xiàn)出地域性差異。

甲霜靈是當(dāng)前防控辣椒疫霉病害的主要農(nóng)藥之一，其抗藥性問(wèn)題一直是研究的熱點(diǎn)之一。王藝燁[19]在遼寧、甘肅、內(nèi)蒙古等地發(fā)現(xiàn)了8 株辣椒疫霉抗藥性菌株；戚仁德等[20]發(fā)現(xiàn)，安徽省16 個(gè)市 (縣) 的125 株辣椒疫霉中敏感菌株、中間菌株和抗性菌株分別占總體的63.2%、30.4%和6.4%，其中最高抗性倍數(shù)達(dá)90 倍；但是本研究中的3 株辣椒疫霉均是敏感菌株，推測(cè)與萬(wàn)寧地區(qū)甲霜靈農(nóng)藥使用較少有關(guān)。

烯酰嗎啉在辣椒疫霉病害防控上廣受關(guān)注，在本研究中，其對(duì)胡椒瘟病菌的EC50值為0.12 μg/mL，該數(shù)值與國(guó)內(nèi)外各地辣椒疫霉上的檢測(cè)結(jié)果一致，比如：張世才等[21]檢測(cè)了重慶地區(qū)的102 株辣椒疫霉菌，崔曉嵐等[22]檢測(cè)了125 株分別采自河北、內(nèi)蒙古、陜西、安徽和北京等地區(qū)的辣椒疫霉病菌，馬輝剛等[23]調(diào)研了江西各地區(qū)的辣椒疫霉菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性，均未發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體；Jackson 等[24]報(bào)道，美國(guó)喬治亞州的甜椒和葫蘆上辣椒疫霉對(duì)烯酰嗎啉均具有良好的敏感性，表明烯酰嗎啉在辣椒疫霉防控具有地域普適的應(yīng)用潛力。

一百多年來(lái)，銅制劑一直是防控植物疫病的重要藥劑，在本研究中喹啉銅、氫氧化銅、氧化亞銅、王銅等銅制劑的EC50值在2.33～10.90 μg/mL之間，對(duì)胡椒瘟病菌具有較好的抑制活性。雖然，Torre 等[25]報(bào)道，大量使用銅制劑可能影響植物新陳代謝和營(yíng)養(yǎng)吸收，但是通過(guò)與其他藥劑復(fù)配或輪換使用，可以提高防治效果和大幅降低銅制劑使用量[26]，其應(yīng)用前景依然十分廣闊。

植物源農(nóng)藥香芹酚和小檗堿被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)及動(dòng)物醫(yī)學(xué)上。在農(nóng)業(yè)上，魏敏等[27]發(fā)現(xiàn)，使用5%香芹酚水劑在2250 mL/hm2劑量下噴霧，其對(duì)馬鈴薯晚疫病的防效可達(dá)83.13%；李寶燕等[28]發(fā)現(xiàn)，0.5%小檗堿水劑對(duì)葡萄霜霉病菌的EC50值為11.85 μg/mL，以有效成分25 μg/mL 的質(zhì)量濃度噴霧施用，其田間防效達(dá)80%以上。在本研究中，兩種藥劑的EC50值分別為27.34 和45.68 μg/mL，綜合其綠色環(huán)保特點(diǎn)，依然具有較好的應(yīng)用潛力。

幾丁聚糖通常作為誘抗劑被大眾認(rèn)知，但其直接抑菌效果也常見(jiàn)報(bào)道。賈瑞秀等[29]發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能夠誘導(dǎo)鐮孢菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的酶活，增加細(xì)胞膜的通透性，達(dá)到抑制菌絲生長(zhǎng)效果。本研究結(jié)果也表明，幾丁聚糖具有一定的抑制辣椒疫霉菌絲生長(zhǎng)作用 (EC50值為312.29 μg/mL)，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

但是，三乙膦酸鋁——當(dāng)前我國(guó)唯一登記防控胡椒瘟病的藥劑，其EC50值高達(dá)659.89 μg/mL。尹敬芳等[30]也發(fā)現(xiàn)，三乙膦酸鋁對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長(zhǎng)、孢子囊形成、休止孢萌發(fā)和孢子囊直接萌發(fā)等4 個(gè)發(fā)育階段的抑制效果均較弱。同樣，多抗霉素是已被多次登記為防控黃瓜霜霉病Pseudopeonospora cubensis、馬鈴薯和番茄晚疫病P.infestans的藥劑，但是在本研究中未檢測(cè)到其對(duì)胡椒瘟病菌有抑制效果。需要注意的是，本研究?jī)H分析了供試藥劑對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，評(píng)價(jià)殺菌劑效果時(shí)還需綜合考慮其他眾多因素，比如對(duì)病原菌產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)等方面的效果，以及藥劑的內(nèi)吸性、傳導(dǎo)性等理化性質(zhì)，等等。此外，還需考慮農(nóng)藥使用限制，比如，福美雙、代森錳鋅、百菌清等殺菌劑已經(jīng)逐步在歐盟等國(guó)家和地區(qū)被限制使用。