沈笑然,朱瑞鋒,郭佳翔,李凌舟,郭洪亮*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院,北京100029;2.河南科技大學 臨床醫(yī)學系,河南 洛陽471000;3.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院,北京100020;4.馬來亞大學,馬來西亞 吉隆坡50603)

RNA干擾(RNAi)的發(fā)現開啟了一場生物學革命,最終表明非編碼RNAs在多細胞生物中是基因表達的中心調節(jié)因子[1]。這些小干擾RNA(siRNAs)很快成為生物學研究中普遍存在的工具,僅通過一個堿基序列就能輕松地抑制任何基因[2-3]。在研究領域中,RNAi不僅被用來調控基因表達、用于病毒性疾病治療、研究基因功能,近年來RNAi技術也被當成一種研究細胞信號轉導通路機制的新方法。本研究應用該技術沉默原代星形膠質細胞(Ast) IL-17表達,探討IL-17的功能[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

增強綠色熒光蛋白(EGFP)表達質粒(武漢,晶賽生物技術公司);Lipofectamine 2000(美國,Invitrogen);熒光顯微鏡(日本,OLYMPUS);C57BL/6小鼠(首都醫(yī)科大學動物實驗中心)。鼠抗IL-17單克隆抗體(武漢博士德生物制品公司)。

1.2 方法

1.2.1體外原代神經膠質細胞的制備 取新生C57BL-6小鼠乳鼠于-20℃冷凍,乙醇消毒,斷頭后取出腦,將分離出的皮層組織用眼科剪盡量剪碎成0.5 mm3的小塊,移入無菌錐底離心管內,加入胰酶,消化,震蕩,反復輕輕吹打組織,直至無明顯組織塊,形成細胞懸液;取細胞懸液過200目篩網后離心7 min,棄上清液,重懸細胞沉淀,計數板計數,之后倍比稀釋到2.0×105·mL-1以傳代備用。

1.2.2IL-17基因沉默質粒的構建及擴增 根據Gen Bank中登錄的小鼠IL-17Am RNA序列(NM_010552.3),參照文獻[5]設計確定3個RNAi 靶點序列為GGTCAACCTCAAAGTCTTTAA、GCAATGAAGACCCTGATAGAT、GCTGGACCACCACATGAATTC,并設計序列TTCTCCGAACGTGTCACGT 為陰性對照。按照Sense+Loop+Antisense+終止信號的方式設計對應的sh RNA序列,Oligo DNA 由武漢晶賽生物技術公司合成。按試劑盒操作說明書進行操作,中量提取超純質粒。

1.3 細胞轉染

分別用pGenesil-1A或B和Lipofectamine 2000轉染原代神經膠質細胞Ast。步驟如下:每孔細胞被稀釋成1.8 μg DNA,以及與稀釋7.5 μl Lipofectamine 2000轉染試劑輕輕混勻,室溫孵育形成DNA-Lipofectamine 2000復合物形成。逐滴加入500 μl 脂質體/DNA混合物到每孔中,搖動培養(yǎng)板使之混勻,孵育3 h。48 h后,熒光鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況,并比較兩段序列的轉染效率。

1.4 沉默效果檢測

選取轉染效率高的質粒和對照質粒pGenesil-1C分別轉染原代神經膠質細胞Ast,與脂質體/DNA混合物作用3 h后換成正常的高糖DMEM培養(yǎng)基后,與空白對照組比較,檢測3組在3、6、12、24、48 h IL-17 mRNA表達。3、4、6 d后檢測蛋白表達。

1.5 實驗分組

實驗組為 SiRNA-IL-17+Ast cell;陰性對照組(NC)(NegativecontrolSiRNA)+Ast cell;空白對照組為Ast cell(control)。

1.6 IL-17蛋白的Western blotting 檢測

急性脊髓炎小鼠模型建立后,在疾病高峰期,麻醉處死大鼠,剪開脊椎骨,取脊髓組織,超聲粉碎,離心取上清,以BCA法測定樣品蛋白含量,上樣,電泳分離,轉印,雜交,結合一抗二抗,DAB顯色,用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描后,Bandscan分析條帶灰度,分別計算靶蛋白條帶的光密度與相對的β-actin條帶光密度的比值,表示各組蛋白表達水平。

1.7 PCR法對IL-17mRNA的檢測

根據Genbank檢索的核苷酸序列用Premier 5.0軟件設計引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。提取細胞總RNA,逆轉錄成 cDNA,加入M-MLV 逆轉錄酶,得到的產物以 GAPDH為內參照進行 PCR 擴增。經過預變性、變性、退火、延伸,30個循環(huán)。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳觀察結果、照相,用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描后,Bandscan分析條帶灰度,分別計算 GDNF條帶的光密度與相對的GAPDH條帶光密度的比值,表示各組mRNA表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

結果以mean±SD表示,應用SPSS13.0軟件(SPSS,Chicago,IL,USA)進行統(tǒng)計學分析,組間差異比較采用單因素方差分析,兩組之間的比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-17基因沉默質粒的鑒定

武漢晶賽生物技術公司構建的特異攜帶有IL-17 RNAi pGenesil-1質粒的彩色圖譜及IL-17短發(fā)夾環(huán)質粒載體基因自動測序圖。DNA測序鑒定結果顯示干擾質粒pGenesil-1A、B均構建成功。

2.2 轉染效率觀察

轉染后48 h在熒光顯微鏡下觀察,因為轉染后可使Ast細胞內有較強的EGFP表達,并在熒光顯微鏡下可被激發(fā),說明轉染獲得成功。結果提示:pGenesil-1B表達的綠色熒光明顯多于pGenesil-1A,分別為56.72%±3.19%、16.72%±1.93%(見圖1)。

圖1 帶有EGFP標記的轉染后的Ast細胞(A、B:400倍,轉染48 h后攜帶綠色熒光蛋白表達的 pGenesil-1B,可見綠色熒光;C、D:400倍,轉染48 h后攜帶綠色熒光蛋白表達的 pGenesil-1A,可見綠色熒光;其中A、C圖為激發(fā)光下的圖片,B、D為正常透光和激發(fā)光下的融合圖片)

2.3 RT-PCR檢測IL-17 mRNA表達量變化

IL-17基因沉默對照組IL-17表達量顯著高于正常對照組,基因沉默組在3、6、12、24、48 h任一時間點IL-17 mRNA表達均低于正常對照組和基因沉默對照組(P<0.05),24 h IL-17比值最低(P<0.05)。見表1,圖2、3。

表1 基因沉默后Ast IL-17 mRNA表達(n=36)

圖2 Ast IL-17 mRNA結果

圖3 不同時間點基因沉默后IL-17 mRNA表達

2.4 Western blotting 檢測IL-17蛋白在3、5、7 d的表達情況

基因沉默模型組IL-17蛋白表達在沉默后3、5、7 d持續(xù)受抑制(P<0.05)。IL-17 RNAiB沉默效果優(yōu)于IL-17 RNAiA,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05。見表2、圖4。

表2 基因沉默后Ast IL-17蛋白表達(n=36)

圖4 IL-17-shRNA慢病毒轉染后,于第3、5、7 d進行IL-17蛋白檢測結果

3 討論

在研究領域,為了解某一蛋白功能,方法之一就是在不表達該蛋白基因情況下,進一步來觀察細胞或者動物的生物學功能特點,來揭示某種蛋白的作用及其機制,最具代表的技術就是RNAi技術和基因敲除技術,RNAi技術主要應用于細胞實驗研究,而后者主要參與動物實驗的研究[6-8]。與基因敲除技術相比,RNAi技術具有操作相對簡單,效果明顯,且技術難度低、費用低、實驗周期短等特點。

本研究應用武漢晶賽生物技術公司構建的特異攜帶有IL-17質粒的圖譜及IL-17短發(fā)夾環(huán)質粒載體基因自動測序圖成功制備IL-17RNAi質粒,制備2條干擾質粒pGenesil-1A、B,均構建成功。因為轉染后可使Ast胞內有較強的EGFP表達,所以應用Lipofectamine2000將質粒轉染Ast后48 h在熒光顯微鏡下觀察是否存在綠色熒光蛋白表達是轉染成功與否的標志。該蛋白可在熒光顯微鏡下被激發(fā)綠色熒光,說明轉染獲得成功,結果提示:pGenesil-1B表達的綠色熒光明顯多于pGenesil-1A,分別為56.72%±3.19%、16.72%±1.93%,說明構建的pGenesil-1B質粒效果更佳,進一步實驗選取pGenesil-1B質粒作為實驗的轉染質粒。同時應用基因沉默技術后觀察原代Ast細胞在IL-17基因沉默較對照組IL-17表達量顯著減低,基因沉默組分別在3、6、12、24、48 h任一時間點IL-17 mRNA表達均低于正常對照組和基因沉默對照組。同時,基因沉默模型組IL-17蛋白表達在沉默后3、5、7 d明顯減少(P<0.05)。另外,IL-17 RNAiB沉默效果優(yōu)于IL-17 RNAiA,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明該技術可以成功抑制IL-17的細胞內表達。

在優(yōu)化轉染條件的過程中,原代的Ast細胞具有良好的生長狀態(tài)是轉染成功的關鍵因素之一。因此,在轉染細胞的選擇上,本實驗選擇原代健康具有活力的Ast細胞用于轉染成功率更高。

總之,應用Lipofectamine2000可成功將IL-17 RNAi pGenesil-1轉染至原代的Ast,轉染效率較高,利用RNAi技術能有效抑制Ast中IL-17基因表達,為研究IL-17在神經系統(tǒng)疾病中的作用提供了有效的方法。